Establishment of In vivo Bioassay Using Giant Duckweed (Spirodela polyrhiza L.) Turion for an Efficient Screening of New Herbicidal Compounds

RESEARCH ARTICLE
김 보관  Bo Gwan Kim1김 진석  Jin-Seog Kim1*

Abstract

This study was conducted to develop In vivo high-throughput screening (HTS) system using giant duckweed (Spirodela polyrhiza L [SPIPO]) turion for new herbicidal agents. In order to increase the reliability of the screening method, it was appropriate to select and inoculate the best turion, and to use dimethyl sulfoxide of 0.5% or less for dissolution of the compound. Based on the results of this study and previous research, basic screening formats using 48 and 96 well plates were established after settling of preparation of turion and chemical solutions, optimal culture conditions, and evaluating criteria of herbicidal activity and symptoms. Then, 26 representative herbicidal agents with different mechanisms of action were tested for a verification of this system. Finally, In vivo HTS for new herbicidal agents named “SPIPO turion bioassay” and its standard protocol was established. This screening method had several advantages such as a use of turions with genetic uniformity, rough distinction of an action type of screening substances, diversification of the experimental conditions, an acquisition and management of the data for various purposes, relatively simple methods and low costs of experiment tools, etc. and seemed to be very useful for a rapid screening of herbicidal substance with new action site, especially.

Keyword



서 언

제초제는 작물의 생장과 수량에 지장을 초래하는 잡초를 억제하는 화학물질로 인류가 농업을 시작한 이래 지속적으로 사용되고 있다(Vat, 2015). 최근 제초제 분야에서는 독성 및 토양잔류 문제, 제초제 저항성 잡초의 급격한 출현과 발생량 증가, 신규 제초제 등록건수의 감소, 국내외 농약관리 제도의 강화 등의 문제점들이 대두되고 있는데, 이들의 문제를 종합적으로 해결하기 위해서는 친환경적이면서 기존의 제초제를 대체할 수 있고 저용량으로 높은 활성을 보이는 신규 작용기작의 제초활성물질을 빠르게 확보해야 한다.

제초제 분야에서 후보물질을 효율적으로 확보하는 방법은 크게 2가지가 있는데, 하나는 표현형 접근법으로 화학물질 라이브러리에서 제초활성을 야기하는 화합물을 선별하고 이후 선별된 물질의 구조동정 및 분자단위로 작용점을 탐색하여 후보화합물을 탐색하는 방법이다(Hicks and Raikhel, 2012). 다른 하나는 표적기반 접근법으로서 목표로 하는 작용점을 설정하고 이에 해당되는 단백질에만 선택적으로 작용하는 화합물을 발굴한 다음 식물에 처리하여 제초활성을 보이는 후보물을 확보하는 방법이다(Subramaniam et al., 2001). 각각의 방법은 나름대로 장단점이 있지만 검정해야 할 화합물 수가 상대적으로 적은 상황에서 보다 신속히 신규 제초제를 개발하려면 표현형 접근법이 보다 효율적이다(Serrano et al., 2015). 다만 제초제 탐색에 있어서 표현형 접근법은 보통 전식물체(whole plant)를 실험재료로 사용하므로 실험에 요구되는 공간과 시간, 비용이 높게 소요된다는 문제가 있다. 따라서 주로 온실에서 수행하는 기존 검정법을 그대로 활용하기 보다는 실험실에서 보다 많은 량을 빠르게 검정해 낼 수 있는 In vivo HTS (high throughput screening)를 접목하는 것이 타당하다. 그 동안 제초제 개발을 위해 사용되어 온 In vivo HTS를 검토해 볼 때, 검정재료로서 애기장대(Arabidopsis thaliana)(Asami et al., 2003; Ricart et al., 2009; Sekimata et al., 2001), 미세조류(Adams and Stauber, 2004; Kasai and Hatakeyama, 1993; Muller et al., 2008; Zhang et al., 2012), 좀개구리밥(Lemna minor)(Hong et al., 2000; Jančula and Maršálek, 2012; Kumar and Han, 2010), 기타 미세 잡초 종자 등이 이용되었다. 그런데 이들 검정법은 재료의 특성에 따라 활용측면에서의 제한들이 존재하는데 쌍자엽식물인 애기장대의 경우는 종자가 너무 미세하여 취급하기가 불편하고, 개체간 생육이 균일하지 않으며, 활성정도와 증상을 규격화 하기 힘든 점이 있다. 좀개구리밥은 단자엽식물로서 개체가 작아 24 well plate 이하에서도 실험이 가능하여 효율성이 우수하지만, 반응이 비교적 단순하며 표적물질에 지나치게 민감하게 반응하는 특징이 있다. 미세조류는 하등식물이기 때문에 고등식물에 대한 활성을 충분히 대변하지 못하며 발현되는 제초증상이 매우 단순하다는 단점이 있다. 기타 잡초 종자의 경우도 작업 효율성, 균일성, 반응성, 대표성 측면에서 비슷한 문제점을 가지고 있다. 따라서 이러한 단점을 보완하고 추가적으로 제초활성 발현증상을 통해 시험화합물의 작용기작을 보다 손쉽게 구별할 수 있는 새로운 In vivo HTS를 확립하면 매우 유용할 것으로 판단되며 이에 적합한 실험재료로서 개구리밥(Spirodela polyrhiza L., 이하 SPIPO라고 표현함) turion을 사용할 수 있을 것이다.

개구리밥은 특정환경에 처했을 때 약 1-2 mm 크기의 영양번식체 휴면아(turion)를 생성하며 이들은 모체로부터 분리된 다음 주변 환경조건이 양호해지면 헛뿌리(rhizoid)와 엽상체(frond)가 발달, 생장하여 새로운 개체로 증식한다. 따라서 일반 잡초종자를 검정용 실험재료로 사용하는 것처럼 SPIPO turion을 같은 목적으로 이용할 수 있는데 그 목적에 따라 잡초종자보다도 활용상에 있어서 더 많은 장점, 즉 취급하기 용이한 크기, 용액에 부유하는 성질, 매우 빠른 출아, 유전적 균일성, 다양한 생장반응 등의 특징(장점)을 가지고 있다(Kim and Kim, 2020). 실제 개구리밥 turion을 활용한 독성 검정법이 확립되어(Baudo et al., 2015) Spirodela polyrhiza microbiotest라는 검정 프로토콜(ISO/NP 20227, 2015)로 제공되고 있고, 아울러 Spirodela Duckweed Toxicity Tests라는 검정 킷트(kit)도 판매되고 있는 상황이다(EBPI, 2020). 그러나 신규제초활성물질 탐색을 위해 활용된 사례는 아직 보고된 바 없다.

본 연구에서는 SPIPO turion의 생장 균일성 확보, 화합물 용매의 적정 사용농도, 검정 플랫폼 구축 및 검정절차 확립, 기존 제초제를 활용한 작용기작별 증상 프로파일링, 신규 화합물을 이용한 활성 검증 등을 통해 신규 제초활성물질의 고효율 탐색을 위한 In vivo HTS를 확립하고자 제반실험을 실시하였다.

재료 및 방법

식물재료

우리나라 논포장에서 채집한 SPIPO를 항온실(27℃, 14시간 광주기, 80 μmole m-2s-1)의 modified DM (MDM) 배지 (Kim and Kim, 2020) 5 L가 함유된 플라스틱 폿트(30×46×19 cm3)에서 계대배양 하면서 생육시켰다. 계대배양중인 SPIPO를 온실조건에서 동일 배지로 키우면서 발생된 turion을 수집한 후 이를 수돗물에 깨끗이 정선한 다음, 사전의 연구보고(Kim and Kim, 2020)에 따라 휴면타파시킨 것들을 실험재료로 사용하였다.

Turion 최아 여부에 따른 엽상체 크기의 균일성 차이

Turion의 최아 여부에 따라 엽상체의 초기생장에 있어서 어느 정도 균일성 차이가 생기는지를 조사해 보았다. 휴면타파 후 최아되지 않은 turion과 최아된 turion을 각각 준비한 뒤 1x MDM배지가 0.3 mL씩 채워진 96 well plate상에 turion을 well당 1립씩 접종한 다음, sealing tape로 plate를 밀봉 한 후 항온실(25℃, 14시간 광주기, 70-100 μmole m-2s-1)에서 5일간 생육시켰다. 그 후 영상장비(DST-8000P, DIGIBIRD, Seoul, Korea)로 plate를 촬영하고 이미지 편집 프로그램(version 12.0 x64, photoshop CS5, Adobe, California, USA)으로 제1엽상체의 최장길이를 각각 측정하였다. 조사된 엽상체 길이의 분포도를 box plot을 사용하여 나타내었다.

검정시 사용되는 용매의 적정농도 탐색

대부분의 시험약제가 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 용매로 하고 있기 때문에 DMSO의 약해가 최소화되는 조건에서 실험하는 것이 바람직하다. 계면활성제로서 Tween 20이 1% 함유되어 있는 DMSO를 가지고 수돗물에 0, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0% 농도로 희석한 다음 직경 5 cm petri dish에 시험용액 7 mL를 분주한 후 휴면타파된 turion을 50립씩 3반복 치상하였다. 이를 항온실(25℃, 14시간 광주기, 50±5 μmole m-2s-1)에서 5일간 배양한 후 발아율과 유묘의 초기 생장 정도를 조사하였다. 건조중은 60℃에서 1일간 열풍건조시킨 다음 측정하였다.

검정 플랫폼 구축

검정 플랫폼으로서 48 well plate와 96 well plate 두가지 조건을 설정하고 각각의 플랫폼에서 검정을 수행하고자 할 때의 적정 용액부피, turion 치상 개수, 검정상의 장단점 등을 검토하였다. 한편, 구축한 검정법의 간단한 검증을 위해 기존제초제 dichlobenil과 glufosinate-ammonium을 대상으로 제초활성 실험을 수행하였다. 48 well plate의 경우, 1x MDM 배지로 조제한 시험용액을 well당 1 mL씩 분주한 다음 휴면타파된 turion을 3개씩 접종하였다. 이를 항온실(25℃, 14시간 광주기, 50±5 μmole m-2s-1)에서 3-4일 배양하여 생장된 제1엽상체 크기를 조사한 후, 무처리구에 대한 상대적 억제 정도로 제초활성을 나타내었다. 한편 96 well plate의 경우는 시험용액을 well당 0.3 mL씩 분주하고 사전 발아된 turion을 1개씩 접종한 다음, 이를 항온실(25℃ 항온, 14시간 광주기, 50±5 μmole m-2s-1)에서 5일간 배양한 후 생장억제 정도를 육안 조사하였다.

작용기작이 다른 기존 제초제들의 활성검정 데이터 확보

작용기작이 다른 기존 제초제들의 활성 기초 데이터를 확보하기 위해 기존 제초제 원제 26종(2,4-dintrophenol, aclonifen, amitrole, asulam, bensulfron-methyl, benzbicyclon, butachlor, cinmethylin, dicamba, dichlobenil, diuron, endothall, fluridone, glufosinate-ammonium, glyphosate, imazethapyr, methiozolin, molinate, oxadiargyl, oxaziclomefone, paraquat, quinoclamine, quizlofop-P-ethyl, sethoxydim, sulcotrione, tiafenacil)을 대상으로 각 약제의 활성 정도와 제초증상을 조사하였다. 시험화합물을 DMSO 또는 증류수로 녹여 용매 stock을 제조하고 이를 1x MDM배지에 희석하여 여러 실험농도로 조제하였다. 이 때 DMSO와 Tween 20의 최종농도는 각각 0.5%, 50 ppm이었다. 시험용액을 96 well plate에 농도 별로 0.3 mL씩 분주 하고 최아된 turion을 well당 1립씩 치상하였다. 항온실(25℃, 14시간 광주기, 70-100 μmole m-2s-1)에서 5일간 생육시킨 후 2x 확대경을 사용하여 육안평가하고 영상장비(DST-8000P, DIGIBRID, Seoul, Korea)를 사용하여 증상을 촬영한 후 이미지 편집 프로그램을(version 12.0 x64, photoshop CS5, Adobe, California, USA)을 사용하여 해당 증상을 기록, 분류하였다.

결과 및 고찰

Turion 최아 여부에 따른 엽상체 크기의 균일성 차이

In vivo HTS를 보다 효율적으로 신속하게 진행하려면 SPIPO turion의 발아가 빠르고 제1엽상체의 생장이 개체간 균일할수록 바람직하다. 따라서 휴면타파된 turion을 사전 발아시키지 않고 접종하였을 때, 발아되지 못하여 false data를 얻을 수 있는 확률과 제1엽상체 생장에 있어서 개체간 차이가 어느 정도 되는지를 조사하는 것이 필요하다. 아울러 turion에 대한 프라이밍처리를 통해 검정기간을 단축하면서 생육의 균일성을 제고시킬 수 있는 방안이 마련된다면 매우 유용한 기술로 활용될 것이다.

Turion의 최아유무에 따른 발아율과 엽상체 초기생장의 개체간 차이를 조사한 결과는 Fig. 1에서와 같았다. 우선 최아된 turion을 접종하였을 때는 미생장 개체가 전혀 관찰되지 않았지만 최아되지 않은 turion을 접종하였을 때에는 평균적으로 3-4% 미만의 미발아(미생장) 개체가 관찰되었다(데이터 생략). 생장된 제1엽상체 크기의 경우 최아 유무간에 각각 3.39, 3.35mm로서 유사했으나, 개체간 크기 분포도에 있어서는 뚜렷한 차이가 나타났다. 즉 최아되지 않은 turion을 접종했을 때의 최소값, 중간값, 최대값, 표준편차는 각각 0.0, 3.8, 4.3, 0.862이었지만(Fig. 1A), 최아된 turion을 접종했을 때는 2.6, 3.3, 4.0, 0.345로서(Fig. 1B) 보다 균일성이 높았다. 따라서 검정의 신뢰도 제고 측면에서 최아된 turion을 사용하는 것이 바람직하겠지만 발아개체 선별에 비교적 많은 시간이 소요되고 turion의 소요량이 상대적으로 많아지는 단점이 있었다. 한편 최아되지 않은 turion을 사용할 경우에는 엽상체의 생장이 상대적으로 불균일하고 실험 목적상 미발아 개체 및 불완전 생장 개체 등 실험 오차로 평가되는 부분이 발생할 여지가 있기 때문에 검정의 신뢰율을 높이기 위해서는 well당 2개 정도의 turion을 접종하거나 프라이밍(priming) 처리 기술(Kim and Kim, 2020)을 적용할 필요성이 있다고 여겨졌다.

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Fig. 1. Size distribution of the first frond generated from not-germinated (A) or pre-germinated (B) turion of Spirodela polyrhiza.

검정시 사용되는 용매의 적정농도 탐색

화합물의 활성검정을 수행하려면 먼저 화합물을 용해시켜 적정농도로 조제할 수 있어야 하며, 이 때 사용되는 용매의 수준은 약해가 없는 농도에서 실시되어야 한다. 대부분의 시험약제가 DMSO를 용매로 하고 있기 때문에 본 실험에서는 DMSO가 turion의 발아와 초기생육에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 발아율의 경우 DMSO 1% 수준까지 대조구와 차이없이 양호하였다(Table 1). 그러나 유묘의 초기 생장은 DMSO 0.25%에서부터 약간씩 저해되기 시작해서 1% DMSO에서는 10% 내외의 생육저해가 나타났다(Table 1). 따라서 검정실험에서는 가급적 0.5% DMSO 이하 농도로 사용하는 것이 바람직할 것으로 여겨졌다.

Table 1. Effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the germination and growth of Spirodela polyrhiza turion.

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z Data represent average ± standard deviation of 3 replicates.

검정 플랫폼 구축

고효율 검정이란 작은 공간에서 일시에 많은 량의 화합물을 검정하는 것을 전제로 하기 때문에 적어도 48 well 이상에서 실험할 수 있어야 한다고 여겨진다. 따라서 본 연구에서는 검정 플랫폼으로서 48 well plate와 96 well plate 두 가지 조건을 설정하고 각각의 플랫폼에서 검정을 수행하고자 할 때의 적정 용액부피, turion 치상 개수, 검정상의 장단점 등을 검토하여 그 결과를 나타내었다(Table 2).

Table 2. Characteristics of the In vivo high-throughput screening (HTS) platforms using Spirodela polyrhiza turion.

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48 well plate의 경우 상대적으로 공간이 넓기 때문에 2-3개의 turion 접종이 가능하였다. 그렇기 때문에 최아되지 않은 turion을 well 당 2-3개 접종하면 false data 발생률을 최소화 할 수 있고 생장 정도도 높일 수 있어서 필요에 따라 정량적 결과를 확보할 수 있을 것 같았다. 한편, 96 well plate의 경우는 well 당 한 개의 turion만 접종하는 것이 바람직하였기 때문에 false data 발생률을 최소화시키기 위해서는 작업시간이 약간 더 소요되더라도 최아된 turion을 사용하는 것이 바람직하였다.

이들의 연구결과와 사전의 turion 발아 및 생육특성 연구결과(Kim and Kim, 2020)를 토대로 SPIPO turion bioassay protocol을 구축하였으며 실험과정을 4단계로 즉, SPIPO turion 관리, 시험약제 준비 및 분주, turion의 접종 및 생육, 제초활성 및 증상의 평가로 나누어 구체적 방법과 실험조건들을 정리하였다(Fig. 2).

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Fig. 2. General protocol of SPIPO turion bioassay established in this study. MDM, modified DM; DMSO, dimethyl sulfoxide; SPIPO, Spirodela polyrhiza.

(1) SPIPO turion 관리: 실험에 활용되는 turion의 저장, 유지, 휴면타파 등 전반적인 turion 관리법을 포함한다. 기본적으로 수집된 turion을 1x MDM배지에 침지하여 4℃냉장고에 60일 이상 저장된 것을 사용한다. 휴면타파된 turion의 사전발아(최아)를 위해서는 동일 배지를 이용하여 25-35℃, 14시간 광주기, 50-100 μmole m-2s-1로 조정된 항온실에서 1-2일간 둔다. Priming 처리가 필요한 경우, 동일 배지를 사용하며 25-35℃로 조정된 암실에서 2-20일간 저장한다.

(2) 시험약제 준비 및 분주: 시험약제 조제를 위한 기본용액은 1x MDM배지로 하며 DMSO 0.5%, Tween 20 0.005%를 포함한다. 각 플랫폼간 사용 가능한 용액의 부피는 48 well plate의 경우 0.5-1.0 mL, 96 well plate에서는 0.2-0.3 mL이지만 가장 최적의 부피는 각각 1.0, 0.3 mL로 한다. 시험약제의 활성을 비교하기 위해 negative 및 positive control를 준비한다.

(3) Turion의 접종 및 생육: Turion 접종 개수는 48 well plate에서는 휴면타파된 turion을 2-3개, 96 well plate에는 최아된 turion을 1개 접종한다. 접종 이후 각 plate를 25-35℃, 14시간 광주기, 50-100 μmole m-2s-1로 조정된 항온실에 두어 2-5일간 생육시키면서 반응을 관찰한다.

(4) 제초활성 및 증상의 평가: 생육 2-5일 이후 2x 확대경 하에서 제초활성 및 증상의 평가를 실시한다. 제초활성의 경우, 0-100% 등급표 (0: 활성 없음, 100: 완전고사)를 기준으로(Table 3) 달관조사를 원칙으로 하며, 특별한 경우 영상장비로 촬영해서 제1엽상체의 크기를 측정하여 정량적 조사를 실시한다. 한편 제초활성 발현 특징을 파악하기 위한 증상의 특징을 나타내기 위해 증상 조사표를 제작하였다. 즉 엽상체 및 근의 생장 정도와 형태, 개체의 컬러변화(bleaching, chlorosis, necrosis, browning, purple 등), 조직 괴사 및 엽상체 해체 유무, 엽맥 가시화, 기타 특징 등을 대변할 수 있는 약어를 설정하여(Table 4) 기록하고 이를 통해 작용유형을 그룹화 할 수 있도록 시스템을 구축하였다. 그리고 영상장비를 사용해 제초활성 발현 모습을 촬영하고 이를 이미지 편집 소프트웨어로 정리해서 데이터베이스화 하여 기초 자료로 활용할 수 있도록 하였다.

Table 3. Rating system of herbicidal activity in Spirodela polyrhiza turion assay.

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Table 4. Abbreviations and their description of herbicidal symptoms in Spirodela polyrhiza turion assay.

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이상과 같이 구축한 검정법의 간단한 검증을 위해 토양처리제로서 cell wall biosynthesis 저해제로 알려진 dichlobenil (Björklund et al., 2011; Encina et al., 2004; Hugo et al., 2010)과 경엽처리제로서 glutamine synthase 저해제로 알려진 glufosinate-ammonium (Herold et al., 1990)을 공시하여 48 well plate와 96 well plate 상에서 각각 실험하였다. 그 결과, dichlobenil은 48 well plate와 96 well plate 모두에서 비슷한 농도-활성 패턴을 나타내었다(Fig. 3). 그러나 glufosinate-ammonium은 엽상체 크기(frond size)를 조사한 48 well plate 실험에서보다 육안조사를 실시한 96 well plate에서 제초활성이 높게 나타났다. 이는 작용기작과 조사방법에 따른 차이 때문으로 여겨진다. 즉 glutamine synthase 저해는 조직의 세포분열억제에 직접적으로 영향을 미치기보다는 chlorosis 및 necrosis 유도를 통한 조직 괴사에 직접적 연관(Davis et al., 2011) 이 있기 때문에 frond size로서는 제초활성이 둔감하게 표현되었을 것이다. 따라서, SPIPO turion assay 시스템에 있어서 여러 가지 작용유형의 제초활성물질의 활성 정도를 잘 대변하려면 다양한 활성지표를 찾아 종합적으로 효과를 나타낼 수 있도록 구체화시킬 필요성이 있다 하겠다.

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Fig. 3. Effect of two herbicides on the growth of Spirodela polyrhiza turion in 48 well plate (A, B) or 96 well plate platform (C, D).

작용기작이 다른 기존 제초제들의 활성검정 데이터 확보

다수의 화합물들 중에서 기존 제초제와 다른 신규 작용기작의 화합물을 가능한 한 신속히 발굴하기 위해서는 검정방법의 효율성뿐만 아니라 화합물의 신규성을 손쉽게 분별할 수 있는 전략이 함께 구축되어야 할 것이다. In vivo HTS의 가장 큰 장점은 전식물체(whole plant)를 사용하여 검정하기 때문에 효소를 이용하는 in vitro HTS와는 달리 흡수/이행/대사 생리가 반영되어 실제장면의 활성을 잘 대변할 수 있을 뿐만 아니라 작용기작이 다른 화합물은 다른 생리현상을 발휘하게 되어 신규 작용생리를 가진 화합물의 발견 확률을 높일 수 있다. 그렇기 때문에 In vivo HTS의 성공적인 운영을 위해서는 무엇보다 기존 제초제들의 활성 관련 정보를 최대한 많이 사전에 알고 있어야 한다.

본 연구에서는 이를 위한 1단계로서 기존에 알려진 26종의 작용기작 유형별 대표 약제를 대상으로, 앞서 구축한 SPIPO turion assay를 실시하여 시험약제별 활성정도와 작용생리(증상)별 화합물군의 프로파일을 확보하고자 하였다. 그 결과, 처리한 제초제들 중 quizalofop-P-ethyl과 sethoxydim을 제외한 23종의 제초제가 활성을 잘 나타내었으며 포장조건에서 저약량으로 처리되는 것들은 본 검정법에서도 매우 강한 활성을 나타내었다(Table 5). Acetyl CoA carboxylase 저해제인 quizalofop-P-ethyl (Huan et al., 2011; Konishi and Sasaki, 1994)과 sethoxydim (Burton et al., 1989; Ruizzo and Gorski, 1988)의 제초활성이 본 검정법에서 나타나지 않았던 이유는 개구리밥 식물 자체가 이들 작용기작의 화합물들에 대해 둔감하기 때문으로 추정된다. 나머지 23종의 제초제 각각에 대한 제초증상을 영상장비를 통해 확보하였으며(Fig. 4), 최종적으로 나타난 증상을 종합하여 크게 8 가지 유형(좀 더 세분하면 10개 유형)의 제초 증상 프로파일로 정리할 수 있었다(Table 6). 예를 들면, 엽상체의 컬러 변화없이 생장만 억제되는 유형(type 1)은 molinate 및 butachlor와 같은 제초제가 속하였으며, 엽상체가 아래로 굴곡되면서 헛뿌리의 뒤틀림이 보이는 유형(type 4)에는 dicamba 및 2,4-D와 같이 오옥신 작용을 나타내는 제초제가 속하였다(Table 6). 향후 여러 가지 기존 제초제에 대한 추가실험을 통해 데이터를 축적하면 더욱 더 상세한 프로파일 제작이 가능할 것으로 전망된다. 이는 완벽하지는 않을지라도 본 검정 과정을 통해 화합물의 작용 유형을 간단히 분별할 수 있고, 이를 통해 신규 작용기작의 화합물을 보다 신속히 탐색하는데 기여할 수 있을 것으로 보인다.

Table 5. Herbicidal efficacy of various herbicides against Spirodela polyrhiza turion.

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yHRAC, Herbicide Resistance Action Committee (https://hracglobal.com/).

zHerbicidal dose inducing 90-100% injury in the early growth of Spirodela polyrhiza turion.

Table 6. Preliminary classification of symptoms induced by various herbicides in Spirodela polyrhiza turion assay.

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Fig. 4. Examples of symptoms induced by various herbicides in Spirodela polyrhiza turion assay. BC: Butachlor; ED: Endothall; BSM: Bensulfuron-methyl; DIC: Dichlobenil; FLU: Fluridone; IMZ: Imazethapyr; CKn: Negative control; GLUa: Glufosinate-ammonium; PQ: Paraquat (methyl viologen); TI: Tiafenacil; MET: Methiozolin; AIT: Amitrole. (Continued)

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Fig. 4. Examples of symptoms induced by various herbicides in Spirodela polyrhiza turion assay. (Continued)

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Fig. 4. Examples of symptoms induced by various herbicides in Spirodela polyrhiza turion assay.

서론에도 언급한 것처럼 Lemna 뿐만 아니라 SPIPO turion을 활성검정 식물재료로 적용한 사례는 여러 연구자들이 보고하였다(Jiang et al., 2012; Müller et al., 2010). 그러나 SPIPO turion의 사전 보고에서는 어느 농도에서 생태독성이 있는지를 조사하기 위하여 주로 제1엽상체 크기 측정을 통해 약해(phyotoxicity) 정도를 나타내고자 하였다. 그런데 이 방법은 조사기준의 제한으로 여러 종류의 활성을 잘 대변하지 못하는 단점이 있다. 예를 들면, 호르몬 교란작용을 나타내는 화합물은 엽상체 크기에는 큰 변동 없이 하향 굴곡 같은 형태적 변형을 일으키기 때문에 엽상체 크기 조사만으로는 실제 활성을 잘 대변시키지 못한다. 또한 생장에 영향을 주지 않고 단순히 백화만을 초래하는 화합물도 단순히 크기만을 조사해서는 약해를 판단하기 어렵다. 그러나 본 연구의 검정방법은 다양한 종류의 화합물들에 대한 종합적 활성평가가 가능토록 조사기준을 다양화 시켰기 때문에 기존 방법의 문제점을 보완, 개선하였고 아울러 활용 목적도 생태독성뿐만 아니라 신규 작용기작의 제초화합물 발굴도 가능토록 하였다는 점에서 차별화된다.

이상에서 본 바와 같이 본 연구에서는 (1) SPIPO turion 관리방법, (2) 시험약제 준비 및 분주, (3) 검정 플랫폼에 따른 turion의 접종 및 생육, (4) 제초활성 및 증상 평가의 단계별로, 효율적 검정에 필요한 제반 요인들에 대한 실험과 검토를 통해 최종적으로 SPIPO turion bioassay를 구축하게 되었다. 이들을 가능하게 한 근본적인 이유는 SPIPO turion이라는 개체 특징 때문이었다. Turion의 크기는 1-2 mm로서 너무 작거나 크지 않아서 48 well 또는 96 well plate에서 취급하기 용이하다. 천립중은 생체중 기준으로 0.85 g, 건물중 기준으로는 0.3 g 정도이다. 그리고 이들 turion은 발아율이 95% 이상 매우 높고, 휴면타파가 되어도 저온 암조건에서는 전혀 발아하지 않기 때문에 오랫동안 보관하면서 검정에 사용할 수 있다. 그리고 소면적 재배를 통해 다량의 turion을 확보할 수 있어 검정재료 확보에도 용이하다. 본 연구실에서는 1.4-1.6 m2 tray에서 1회에 약 200 g 생산할 수 있는데 이는 약 20만개 약제를 검정할 수 있는 양이다. 종합적으로 본 연구에서 확립한 In vivo HTS로서의 SPIPO turion assay의 특징을 몇 가지로 요약해 보면, 1) 유전적으로 균일한 영양번식체 검정식물(SPIPO turion)을 외부 자연환경에 지배받지 않고 항상 이용할 수 있다. 2) 소규모 공간에서 비멸균 조건하에서 많은 화합물에 대해 In vivo 검정이 가능하며, 생장이 비교적 빠르기 때문에 2-5일만에 검정이 완료될 수 있다. 3) 실험 경비가 낮게 소요된다. 즉 단순한 시설과 실험장비로 검정할 수 있으며, 배양방법, 화합물 처리 등 제반 작업이 용이하다. 4) 미세조류 또는 애기장대 등에 비해 다양한 증상이 발현되어 제초활성물질의 작용유형 구별도 어느 정도 가능하다. 5) Turion 크기가 작고 부유식물이기 때문에 다양한 처리조건 구사가 가능하다. 6) 촬영된 이미지와 포토샵 프로그램을 이용하여 생육 정도(제1 엽상체 크기 및 면적), 칼라 변화를 정량화 시키기 용이하다. 따라서 본 검정방법은 신규 제초활성물질의 고효율 검정에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Acknowledgement

This research was supported by a grant of Institute-Based R&D through the Korea Research Institute of Chemical Technology (Project No: SI 1608 and KK 2061-24).

Authors Information

Bo Gwan Kim, https://orcid.org/0000-0002-0031-9033

Jin-Seog Kim, https://orcid.org/0000-0002-9939-522X

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