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기존에 시판 중인 제초제에 대한 전 세계적인 저항성잡초의 출현, 인축과 환경독성에 대한 일반인들의 우려 증가는 농약산업계 및 관련 학계에 새로운 작용점(target site) 혹은 작용기작(mode of action)을 갖는 신규 제초제 개발의 필요성을 촉진하고 있다(Duke, 1992; Kim, 2006a). 1950년대부터 1980년대 중반까지 광합성계, 아미노산 생합성 저해, 지방산 생합성 저해, 긴 사슬 지방산 생합성 저해, 클로로필 생합성 저해, 옥신(auxin) 유사작용 등의 작용기작을 갖는 제초제들이 개발되었으나 1980년대 HPPD (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) 타켓 제초제가 개발된 이래로 상업화된 새로운 작용기작을 갖는 제초제는 출시된 바가 없다. 그러나 최근 fatty acid thioesterase (FAT)가 새로운 제초제 작용점으로 대두되었다. 이를 저해하는 제초제로는 cinmethylin을 들 수 있는데, 이는 1980년에 수도용 제초제로 개발되었다가 상업적으로 성공하지는 못하였지만 저항성 잡초에 대한 살초효과가 입증되어 재상업화가 시도되었고, 연구를 통해 작용점이 구명되었다(Campe et al., 2018). 그리고 2019년에는 시아노박테리아가 생산하는 광합성산물인 7-deoxy-sedoheptulose가 제초제 개발을 위한 작용점으로 제안되기도 했으나(Brillsauer et al., 2019) 현재까지 제초제로의 개발은 이루어지고 있지 않다. 신규 제초제 작용점의 발견과 관련된 제초제의 개발은 제초제 저항성 잡초문제를 해결하는 데에는 매우 효과적일 것이라 판단된다.
제초제 저항성잡초의 방제를 위해 새로운 작용점을 갖는 제초제 개발이 대두되고 있음은 주목할만하다. 신규 제초제를 개발하는 방법으로는 무작위 유기합성된 살초활성물질을 스크리닝하는 방법(random screening), 개발되어 있는 제초제의 구조를 모방하는 방법(me-too approach), 작용점 저해 화합물을 컴퓨터를 이용하여 설계하고 고활성의 제초활성물질을 합성하는 생합리적 방법(biorational design), 그리고 천연물로부터 살초활성물질을 탐색하는 방법(environmental biochemistry)을 들 수 있다(Duke et al., 2000). 이차대사산물이 풍부한 식물로부터 살초활성을 갖는 화합물질을 탐색하고, 이를 바탕으로 제초제를 개발하는 것은, 그 재료의 소재가 우리나라에만 국한되어 있고 이에 관한 자료가 확보된 경우에는, 높은 기술력을 보유하고 있음에도 불구하고 충분한 자본의 투입이 없어 개발에 있어서 어려움을 겪고 있는 우리나라의 제초제 개발자들에게는 호재가 될 것이라 판단된다(Kim, 2006a). Environmental biochemistry의 성공예는 Syngenta AG에서 개발한 mesotrione (Callisto)를 들 수 있다. Mesotrione은 아열대 지역에서 자라는 향료식물인 bottle brush (Callistemon citrinus)의 뿌리에 함유된 알렐로파시 화합물 leptospermone으로부터 개발된 것으로 옥수수밭의 광엽잡초를 제어하는 탁월한 제초효과를 보인다(Mitchell et al., 2001).
본 논문의 연구진은 제초제 개발을 위한 선도물질을 탐색하고자 국내 자생식물을 수집하고, 그 추출물의 살초활성을 검정하는 일련의 연구를 수행하고 있으며 2003년 이래로 약 1,200여 종의 국내 자생식물의 살초활성 검정 결과를 농약 및 잡초 관련 논문에 발표하였다(Hong et al., 2021, Kim, 2006a; Kim et al., 2003a, 2004, 2005b). 그리고 이들 식물로부터 살초활성물질인 anemonin (Choi et al., 2003), chrysophanic acid (Kim et al., 2003a), elemicin (Kim et al., 2005a) 등을 분리동정하고 한국잡초학회지에 보고한 바 있다. 살초활성물질이 함유된 식물추출물은 친환경농업용 생화학 작물보호제 개발이나 제초제 개발을 위한 모화합물을 제공할 수 있을 것이라 판단된다.
본 논문에서 그동안 대량 수집이 어려웠던 30과 54종의 외래식물을 수집하고, In vitro 실험과 온실실험을 통해 살초력을 검정하였기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
식물시료 채취 및 조제
실험에 사용된 54종 식물 시료는 모두 외래식물로 알려져 있으며, 2022년 5월부터 11월까지 전국 일원에서 채집하였다. 채집은 식물분류학 전공의 강원대학교 장근정 박사에 의해 수행되었으며, 분류학적으로 형태가 의심스러운 시료에 대해서는 Lee (2003)과 Lee (2006)의 식물도감을 참조하였다. 채집된 식물시료는 온도 25℃, 습도 50%가 유지되는 강원대학교 천연물 실험실에서 음건한 후, 온도 50℃의 건조기에서 완전건조하고 분쇄기를 이용하여 0.6 mm 이하로 마쇄하였다. 본 연구에 사용된 식물은 총 30과 54종이었으며, 식물의 과학명과 과명은 국가표준식물목록(Korean Plant Names Index Committee, 2022)을 참조하여 정리를 하였으며, 수집된 식물시료의 일반명, 과명, 학명과 채집장소는 Table 1에 나타내었다.
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Table 1. The collected plant samples from various places in Korea for this experiment. Total of 54 plants in 30 families were collected and classified by taxonomist Dr. Geun Jung Jang. 
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MeOH 추출물
식물시료는 기존의 보고(Kim et al., 2003a)에서 했던 방법에 따라 동일하게 methanol (MeOH) 추출물을 제조하였다. 건조된 시료 100 g을 5-L Erlenmeyer flask에 넣고 MeOH 2 L를 첨가한 후, 100 rpm의 진탕기에서 24시간 2회 반복 추출하였다. 추출된 용액을 여과지가 깔려 있는 Büchner funnel에 통과시켜 잔재물을 제거하고 감압농축기(EYELA NE-1101, Tokyo, Japan)로 완전 농축시킨 후, d-H2O를 50 mL 첨가하여 flask 내의 건조물을 충분히 용해시켰다. 최종적으로, d-H2O에 용해된 추출물은 동결건조기(ILSHIN LAB, Seoul, Korea)를 이용하여 건조시켰으며, 동결건조가 완료된 시료는 4℃ 의 냉장고에 보관하면서 살초활성검정에 사용하였다.
살초력 검정
54종 식물의 MeOH 추출물에 대한 살초력 검정은 In vitro 실내실험과 온실실험을 수행하여 검정하였다.
In vitro seed bioassay
동결건조된 54종 식물의 MeOH 추출물을 d-H2O로 희석하여 10,000 μg g-1 농도의 저장용액(stock solution)으로 조제한 후, 저장용액으로부터 약량을 달리하는 처리액(working solution: 0; 2,000; 4,000; 6,000; 8,000 and 10,000 μg g-1)을 제조하였다. Twenty four-well tissue culture plate (SPL life sciences, Pocheon, Korea)의 각 well에 sea sand 1.0 g (Daejung 10-20 mesh, Siheung, Korea)을 넣고 그 위에 5립의 유채(Brassica napus L.)와 3립의 나팔꽃(Ipomoea nil (L.) Roth) 종자를 치상한 다음 처리액을 적가하였다. Plate를 온도 25℃, 습도 70%, 광도 250 umol m-2 s-1 조건의 식물생장상에서 생장시켰다. 모든 실험은 3반복 수행되었으며, 나팔꽃 종자는 처리액 처리 3일 후, 유채 종자는 처리 5일 후 유식물의 생체중 및 신초길이를 측정하여 각 종자에 대한 생장을 무처리에 대비하여 50% 저해할 수 있는 약량인 GR50값을 구하였다.
Greenhouse experiment
살초활성 평가를 위한 온실 실험은 대전 소재의 ㈜목우연구소 온실에서 수행하였다. 대상식물은 작물 5종 옥수수(Zea mays), 콩(Glycine max), 목화(Gossypium indicum), 밀(Triticum aestivum), 벼(Oryza sativa)와 화본과잡초 4종 물피(Echinochloa crus-galli var. echinata), 바랭이(Digitaria sanguinalis), 쥐꼬리뚝새풀(Alopecurus myosuroides), 호밀풀(Lolium perenne), 그리고 광엽잡초 4종 둥근잎유홍초(Quamoclit coccinea), 어저귀(Abutilon theophrasti), 털비름(Amaranthus retroflexus), 댑싸리(Bassia scoparia)를 일반 밭토양(Sandy loam, Daejeon), 원예용상토(Bunong Horticulture Mix #2; Bunong Industry, Gyeongju, Korea), 수도용상토(Bunong rice nursery media; Bunong Industry, Gyeongju, Korea)가 1:1:1(v/v/v) 비율로 혼합된 토양이 담겨있는 사각플라스틱 포트(W 22 cm × H 8 cm × D 15.5 cm)에 1 cm 심도로 파종하였다. 토양처리는 약제 처리 하루 전, 경엽처리는 처리 10~14일 전에 대상식물들을 파종하였다. 처리를 위해 각각의 추출물을 0.1% Tween 20이 첨가된 50% acetone 수용액으로 용해하여 4 kg a.i. ha-1 약량으로 조제하였고, Teejet 8002 EVS (Flat fan nozzle, Teejet technologies, Illinois, USA)가 장착된 CO2 Track sprayer (Korea Plant and Environmental Research Station, Suwon, Korea)를 이용하여 1,000 L ha-1 살포물량으로 처리하였다. 파종 및 처리된 포트들은 온도(낮 25~30℃, 밤 20~25℃)가 일정하게 유지되는 온실에서 생육되었고, 조사는 약제 처리 14일 후에 달관평가(0-10, 0: 효과없음, 10: 완전고사)를 실시하였다.
결과 및 고찰
본 연구를 위하여 전국으로부터 54 종의 외래식물을 수집하였다. 수집된 외래식물은 가지과(Solanaceae) 2종, 감나무과(Ebenaceae) 1종, 국화과(Asteracaceae) 10종, 꼭두서니과(Rubiaceae) 2종, 꿀풀과(Lamiaceae) 1종, 능소화과 (Bignoniaceae) 1종, 미나리아제비과(Ranunculaceae) 2종, 마타리과(Valerianaceae) 1종, 미나리과(Apiaceae) 1종, 배추과 (Brassicaceae) 1종, 백합과(Liliaceae) 1종, 버드나무과(Salicaceae) 1종, 범의귀과(Saxifragaceae) 1종, 벼과(Poaceae) 1종, 비름과(Amaranthaceae) 2종, 석류풀과(Molluginaceae) 1종, 석죽과(Caryophyllaceae) 1종, 소나무과(Pinaceae) 2종, 쐐기풀과 (Urticaceae) 1종, 아욱과(Malvaceae)1종, 앵초과(Primulaceae) 1종, 양귀비과(Papaveraceae) 1종, 인동과(Caprifoliaceae) 1종, 장미과(Rosaceae) 4종, 제비꽃과(Violaceae) 1종, 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae) 1종, 쥐손이과(Geraniaceae) 1종, 질경이과 (Plantaginaceae) 1종, 콩과(Fabaceae) 5종, 현삼과(Scrophulariaceae) 4 종으로 총 30과(family)이었다 (Table 1).
In vitro seed bioassay
총 54종 식물의 MeOH 추출물 처리액을 5립의 유채(Brassica napus L.)와 3립의 나팔꽃(Ipomoea nil) 종자가 각각 치상된 24-well tissue culture plate에 처리한 다음 처리 3일 후 나팔꽃, 처리 5일 후 유채 유식물의 생체중과 신초 길이를 측정하였다. 유채와 나팔꽃 종자의 발아율은 95% 이상이었으며, 통계 분석을 위한 데이터를 얻기에 충분하였다. 본 연구를 위해 유채와 나팔꽃을 대상으로 GR50값을 구하였으나 나팔꽃의 경우 종자 무게와 신초 길이가 GR50값을 결정하는데 큰 영향을 미치지 않았기에 유채 종자의 결과만을 Table 2에 나타내었다. 그리고 신초 길이 보다는 생체중의 GR50값이 높았는데(예를 들면 개구리자리의 경우 3,723 μg g-1 vs 8,651 μg g-1; 개비름의 경우 3,719 μg g-1 vs 6,096 μg g-1) 본 논문에서는 생체중을 기준으로 GR50값을 구하고 살초력을 평가하였다.
본 연구에서 외래식물 54종 MeOH 추출물의 살초활성을 In vitro에서 유채를 대상으로 조사한 결과, 본 연구자들이 고활성이라고 기준을 세워 두었던 기준(GR50 < 1,000 μg g-1, Kim, 2006a)에 미치는 시료는 발견되지 않았다. 중정도의 살초활성(1,000 μg g-1 < GR50 < 2,000 μg g-1)을 보이는 시료는 중대가리풀(Centipeda minima (L.) A. Braun & Aschers.)이 유일하였다(Table 2).
Greenhouse experiment
온실조건에서 작물 5종, 화본과잡초 4종 그리고 광엽잡초 4종에 대하여 발아전(파종 직후)과 생육기(파종 후 10일)에 각각의 외래식물 추출물들을 4 kg a.i. ha-1을 처리하고 14일 후에 달관평가를 실시하였다. 그 결과 4 kg a.i. ha-1 약량에서는 모든 추출물들이 약효가 낮거나 없었으며 무처리에 대비하여 약간의 생육억제만 나타날뿐 다른 살초증상은 나타나지 않았다(Table 3).
In vitro 실험과 온실시험간의 결과를 비교하면 상이한 살초효과가 나타났는데 홍 등(Hong et al., 2021)이 온실에서는 살초효과에 대한 변동 요인이 있다고 보고하였으며, 그 요인으로는 관수에 의한 용탈, 광분해, 토양 미생물에 의한 생물학적 분해 등에 의하여 약효가 경감되는 것이 실험에 영향을 미친 것으로 추측된다.
외래식물 MeOH 추출물을 토양처리시 귀룽나무(Prunus padus L.), 일본잎갈나무(Larix kaempferi (Lamb) Carriere), 독말풀(Datura stramonium L.), 공작초(Tagets patula L.) 추출물은 댑싸리(Bassia scoparia), 털비름(Amaranthus retroflexus), 바랭이(Digitaria ciliaris)는 생육억제만 나타났고 경엽처리시에도 개불알풀(Veronica polita Fr.), 공작초(Tagets patula L.)와 골담초(Caragana sinica) 추출물은 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)에 대하여, 개비름(Amaranthus lividus) 추출물은 옥수수(Zea mays L.)에 대해서 생육억제 증상만 나타났다(Table 3). 한편 실험에 사용된 다른 외래식물 MeOH 추출물들은 토양처리나 경엽처리시에도 아무런 약해증상이나 약효증상을 나타내지는 않은 것으로 보아 살초활성물질을 함유하지 않았거나 혹은 살초력을 나타나기에는 미약한 것이라 판단된다. 이는 국내에 유입된 외래잡초들이 알렐로파시(allelopathy)를 통해 생태계를 교란하는 등의 심각한 생태계 위해는 현재까지 나타나지 않은 것이라는 점을 시사하여 준다.
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Table 3. Efficacy and phytotoxicity of MeOH extracts of exotic plants in a greenhouse condition. Application dose of extracts are 4 kg a.i. ha-1. Visual evaluation was performed at 14 DAA. 
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본 연구의 저자들은 국내에 서식하고 있는 자생/외래식물로부터 살초활성 탐색을 지속적으로 수행하는 한편(Hong et al., 2021, Kim, 2006a; Kim, 2006b; Kim, et al., 2003a, 2004, 2005b), 이에 함유되어 있는 살초활성물질을 분리동정하는 작업을 수행해왔다. 국내 자생식물에 함유된 살초활성물질을 모화합물(mother compound)로 하여 활성이 높은 제초제를 개발하는 것이 목적이었으며, 저자들은 지금까지 국내 자생식물인 족도리(Asarun sieboldii Miq.)로부터 elemicin (Kim et al., 2005a), 애기수영(Rumex acetosella L.)으로부터 chrysophanic acid (Kim et al., 2003b), 할미꽃(Pulsatilla koreana L.)으로부터 anemonin (Choi et al., 2003), 가시박(Sicyos angulatus L.)으로부터 3-Hydorxy-9H-xanthine-9-one (Cho et al., 2010a), 소리쟁이(Rumex crispus L.)로부터 angelicin (Cho et al., 2010b)을 분리동정하여 보고한 바 있다.
본 연구에서 유채를 대상으로 외래식물 54종 MeOH 추출물의 살초활성을 In vitro에서 조사한 결과, 본 연구자들이 고활성이라고 기준을 세워 두었던 기준(GR50 < 1,000 μg g-1, Kim, 2006a)에 미치는 시료는 발견되지 않았다. 중정도의 살초활성(1,000 μg g-1 < GR50 < 2,000 μg g-1)을 보이는 시료는 중대가리풀(Centipeda minima (L.) A. Braun & Aschers.)이 유일하였다. 이러한 결과는 국내 생태계에 악영향을 끼치는 외래식물은 아직 유입되지 않았을 가능성이 크다는 것을 시사한다.
중대가리풀은 국화과의 일년생식물로 길가나 논과 밭둑, 시설원예지 또는 습기가 있는 뜰에 주로 서식하며(Lee, 1996), 일명 토방풀, 땅꽈리로 알려져 있다(Lee, 2005). 중대가리풀에는 항종양, 특히 항비인두암(You et al., 2018), 항산화 및 항염(Sarkar et al., 2017), 항신경염증(Li et al., 2020) 특성이 있다고 보고된 바 있으며 우리나라의 민간에서는 만성비염을 비롯한 콧병, 눈병 및 두통 치료에 사용하였다. 또한 그 추출물은 Escherichia coli BE 1186 균주에 대하여 강한 항균 활성이 있으며, 바랭이(Digitaria sauguinalis)에 대해서 발아저해 또는 생육저해활성이 있어 향후 제초제 개발 가능성이 있다고 보고되었다(Kim et al., 1996). 중대가리풀에는 arnicolide A, arnicolide C, arnicolide D, minimolide F, microhelenin A, brevinine A, deoxydelphantopin과 같은 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone) 화합물(Chan et al., 2019; Yao et al., 2022)들이 존재하는 것으로 보고된 바 있다. 세스퀴테르펜 락톤은 식물이 생성하는 이차대사산물 중 이소프렌(isoprene)의 중합된 탄소수가 15개인 화합물로 약 5,000여개가 Vladimiria souliei (Chen et al., 2017), Saussurea costus (Falc.) Lipsch (Lee et al., 2018), Campuloclinium macrocephalum (Cabral et al., 2020), Elephantolus scaber Linn. (Han et al., 2020) 등 다양한 식물에서 보고되었고, 대표적인 화합물로는 eudesmanolide, gaianolide, psedoguaionolide, germacranolide, xanthanolide 등을 들 수 있다. Abdelgaleil et al. (2017)은 southern magnolia의 나무껍질로부터 분리한 costunolide와 parthenolide를 야생 귀리에 처리한 결과, 야생 귀리의 발아와 생장이 농도 의존적으로 억제되었고 그 작용점은 acetolactate synthase 일 것이라 제안하였다. 따라서 저자들의 연구결과로부터 살초효과가 있는 세스퀴테르펜 락톤의 화학구조 개선 혹은 변경을 통해 제초활성을 최적화시킬 수 있을 것이라 예상되며, 향후 더 많은 세스퀴테르펜 락톤의 제초효과 연구를 통하여 새로운 환경친화적 제초제를 개발할 수 있을 것이라 기대된다.
Acknowledgments
This study was supported by joint research project from the Ministry of Environment, Republic of Korea (project number: 2018002270001).
Authors Information
Nam-Kyu Cho, Moghu Research Center, Senior Researcher
Ki Hwan Hwang, Moghu Research Center, Executive Vice President, Ph. D.
KunJung Jang, Kangwon National University, Senior Researcher
Minji Hong, Kangwon National University, Ph.D. student
Sunhee Hong, Hankyung National University, Professor
Songmun Kim, https://orcid.org 0000-0002-8032-7569,
