Introduction
나노버블(nanobubble)이란 액체 내부에 기체가 분산되어 발생한 기포로 직경의 크기가 200 nm 인 것을 의미하며, 직경의 크기가 10-50 μm 크기를 미세버블 (microbubble) 이라고 한다(Agarwal et al., 2011; Takahashi, 2005). 직경 50 μm 이상의 크기를 가진 조대기포의 경우 수중에서 수면위로 올라가는 속도가 입자들의 브라운 운동 속도보다 빠르게 이동하여 기포가 쉽게 터져 소멸되는데 비해, 나노버블 혹은 미세버블의 경우 수면위로 이동하는 속도가 브라운 운동 속도보다 상대적으로 느리기 때문에 이동하는 동안 내부기체를 외부로 유출하여 수중에서 서서히 용해되거나, 조대기포 보다 오랫동안 용액내에서 존재하다 최종적으로 수면위에서 소멸되는 특성을 가지고 있다(Lee and Kim, 2019). 또한 상대적으로 오랜 시간동안 수중에서 존재하게 되는 나노버블은 표면이 음전하의 성격을 띠게 되어 물속의 부유물질 등과의 흡착성이 매우 높아지게 되며, 흡착된 이물질은 나노버블이 소멸하면서 발생되는 높은 에너지와 화학적으로 불안정한 활성산소 라디컬에 의해 제거된다(Ebina et al., 2013; Matsuki et al., 2012; Tano et al., 2013). 이러한 나노버블이 가지고 있는 독특한 특성 때문에 나노버블을 이용한 잠재적 효과를 검증하는 연구가 다양한 분야에서 수행되어 왔으며, 특히 녹조 제거와 같은 수질정화 및 박테리아를 살균하는 세정 효과에 대한 연구결과들이 지속적으로 발표되어 오고 있다(Han et al., 2006; Bui and Han, 2015; Pongprasert et al., 2016; Tano et al., 2013).
나노버블에 의한 용존산소의 증가는 수질정화 및 세정효과 등의 연구결과 이외에 식물의 성장촉진과 발아속도 향상 등에 관련된 연구결과도 지속적으로 보고되고 있다. 식물의 성장촉진을 위해 나노버블은 성장 억제요인을 제거하거나, 성장에 필요한 기체공급이나 영양분 공급을 용이하게 하여 성장을 촉진하는 것으로 선행연구들은 보고하고 있다. Alfalfa sprouts (Medicago sativa)에 오존이 처리된 나노버블과 수돗물 및 염소수를 처리후 비교한 선행연구 결과에서 오존이 처리된 나노버블과 염소수 처리군에서 Escherichia coli 와 Salmonella spp. 등의 세균 개체수가 검출되지 않아 살균효과가 입증되었으며, 염소수 처리군에서는 발아율과 생체중이 감소하였으나 오존이 처리된 나노버블 처리군에서는 부정적인 효과가 나타나지 않아 발아율과 생체중의 감소는 나타나지 않았다(Kwack et al., 2014). Barley (Hordeum vulgare)에 나노버블에 의한 용존산소 증가 처리후 수도물 처리군과의 비교실험에서는 나노버블 처리군에서 발아속도가 15-25% 향상된 결과가 나타났다고 보고된 바 있다 (Liu et al., 2013). Ebina et al. (2013)은 배추(Brassica campestris)에 증류수와 30 mg L-1 의 나노버블 처리에 의한 용존산소 증가된 처리구 비교실험에서 증류수 처리군보다 30 mg L-1 나노버블 처리군에서 배추의 지상부 높이 14.4%, 잎의 길이 8.9%, 생체중 34.5% 가 각각 증가하였다고 보고하였다. Park and Kurata (2009)는 상추(Lactuca sativa)의 수경 배양중 나노버블을 주입한 실험을 진행하였으며, 배양 결과 나노버블은 용존산소 농도와 관계없이 지상부의 생체중 및 건물중 증가, 입의 수 증가, 잎의폭 증가, 지하부 건물중 증가등 식물의 성장량 증가에 유의미한 영향을 주었다고 보고한 바 있다. 또한 식물성장의 긍정적 효과에 대한 원인으로 미세버블의 표면이 음전하의 성질을 나타내기 때문에 영양분이 있는 용액에서 양전하 성질을 가지고 있는 영양원소의 흡착을 야기시켜 성장을 촉진시킨다고 보고하였다. 이러한 선행연구들의 결과에 의하면 나노버블의 효과는 버블의 소멸시 발생하는 높은 에너지, 버블 표면의 음전하, 버블 내부의 압력으로 인한 용존산소량의 증가 등으로 요약이 된다. 다양한 식물에서 나타난 결과와 같이 식물의 발아 및 성장에 대한 미세버블의 긍정적인 효과는 잔디의 발아 및 생육에도 영향을 줄 수 있을 것이라고 기대할 수 있으나 아직 미세버블이 잔디의 생육에 미치는 효과에 대한 연구결과는 보고되고 있지 않다. University of Georgia의 Mussie Habteselassie 교수가 이끄는 연구팀에서는 미세버블과 잔디생육에 대한 연구가 2020년 부터 진행중에 있으며, 호주의 Avondale Golf Club 에서는 2017년 부터 골프코스내의 잔디관리를 위해 미세버블을 이용해 오고 있는 등 연구와 산업에서 일부 미세버블을 이용하는 사례가 있으나 국내에서는 미세버블의 잔디에 대한 효과에 대한 이용사례나 연구결과는 아직 보고되고 있지 않다(Clarke, 2019; Habteselassie et al, 2021).
따라서 본 실험에서는 미세버블에 의한 용존산소의 농도에 따른 3가지 한지형 잔디 초종의 발아율과 필드에서의 피복률 조사를 통한 잔디밭 초기조성에 대한 효과를 검증하기 위해서 수행되었다.
Materials and Methods
시험 기간 및 공시 재료
본 실험은 대한민국 충청남도 아산에 위치한 호서대학교 잔디환경실험장에서 발아실험과 필드실험으로 수행되었다. 발아실험은 9월 16일부터 10월 21일까지, 필드실험은 9월 27일에서 11월 21일까지 각각 수행되었다. 본 실험에서 사용된 초종은 발아실험과 필드실험 모두 동일한 한지형잔디 3종이 사용되었으며 Kentucky bluegrass, KB (Poa pratensis) 'Endurance', Perennial ryegrass, PR (Lolium perenne) 'Gray Fox', Tall fescue, TF (Festuca arundinacea) 'Rising Moon' 이 각각 사용되었다. 용존산소 농도 조절을 위한 나노버블 공급은 나노버블 제조기 (M0508S304, Oxy-Bank & WholeGreen Nano Inc., Incheon, South Korea)를 통하여 생산된 나노버블을 tap water에 주입하여 용존산소 농도를 조절하였다. 나노버블 제조기를 통하여 생성된 버블 직경의 크기는 nanoparticle tracking analysis (NTA)기법을 이용하는 NanoSight NS300 (NanoSight Analysis, Malvern Panalytical, Bundang, South Korea)를 통해 생성된 나노버블의 직경과 개체수를 측정하였다. 분석결과 나노버블의 평균 직경은 171.4 nm로 본 실험에서 사용된 버블은 미세버블보다 작은 나노버블로 분류가 되는 것으로 나타났다(Fig. 1). 나노버블 공급 후 용존산소 농도를 측정하기 위하여 Oxy-Guard (Oxy-Guard Handy Polaris, OxyGuard, Farum, Denmark)가 사용되었다. 실험에 사용된 처리구는 나노버블 공급이 되지 않은 Tab water 그리고 나노버블 공급 후 용존산소가 각각 10, 20, 30 mg L-1 의 3가지 농도가 사용되었다(Table 1). Tap water의 용존산소량은 측정결과 약 6-8 mg L-1으로 나타났다.
발아실험에서 공시재료로 사용된 초종의 종자는 직경 90 mm, 높이 10 mm의 Petri-dish 내에 필터페이퍼 (Whatman f ilter paper No. 1, Cytiva, Marlborough, USA) 를 2매씩 배치 후, 필터페이퍼 윗면에 처리구별 50립씩 3반복으로 치상하였다(Baskin and Baskin, 1998). 발아실험은 국제종자검정협회에서 제시한 ISTA 변온환경에서 수행되었다(ISTA, 2004). ISTA 변온환경은 광과 온도 등의 생육환경 조절이 가능한 식물생장상(GC-1000, Jeio Tech. Daejeon, South Korea) 내에서 수행되었다. 오전 9시부터 오후 5시까지 8시간 동안 광조건으로, 그리고 오후 5시부터 다음날 오전 9시까지 16시간 동안 암흑 조건으로 하였다. 발아상의 온도는 광조건 하에서 25℃, 암흑 조건하에서는 15℃로 유지하였으며, 광조건시 광원은 Fluorescent lamp로 light intensity 는 98 μmol m-2 s-1로 실험기간동안 광조건시 유지되었다 (Ahring and Todd, 1978; Mollard and Naeth, 2014). 관수는 매일 8시간 간격으로 4 ml씩 3회에 걸쳐 총 12 ml d-1의 수분이 공급되었으며, 실험기간동안 식물생장상 내의 상대습도는 75-80%가 유지 되었다(Hurdzan, 1969). 발아율 조사는 실험시작후 실험종료까지 매일 총 36회 조사를 하였다. 발아율 측정의 기준은 지상부 잎 조직이 5 mm 정도 자랐을 때를 기준으로 하였으며 최종 발아율은 실험종료일까지 조사한 누적 발아율을 이용하였다.
필드실험은 USGA 규격에 적합한 모래에 본 실험에 공시재료로 사용된 한지형초종 3가지를 파종하였다. 파종전 복합비료(N:P2O5:K2O=11:5:7, NPKO®, Pungnong , Seoul, South Korea)를 5 g N m-2 비율로 전체 실험구에 시비되었다. 한지형초종과 용존산소농도 처리구를 위해 1 x 0.5 m 크기의 실험처리구가 구성되었다. 나노버블에 의해 용존산소가 조정된 농도별 관수량과 tap water의 관수량은 1회 0.6 cm 깊이로 오전 8시 그리고 오후 4시에 매일 2회 총 토양 1.2 cm 깊이로 처리구에 관수되었다. 초기 조성률을 측정하기 위해 National Turfgrass Evaluation Program (NTEP)에서 제시한 잔디피복률(Turf coverage, %)이 육안평가에 의해 3일 간격으로 실험기간동안 수행되었다.
본 실험의 설계는 식물생장상 발아실험과 필드실험 모두 난괴법(Randomized Complete Block Design) 3반복으로 이루어져 수행되었다. 통계분석은 SAS 프로그램(SAS Institute Inc., 2001)을 이용하여 The General Linear Model procedure (PROC GLM)으로 데이터 분석이 수행되었으며, 주처리구의 유의차 분석을 위해 Fischer’s protected least significant difference (LSD)가 수행되었다.
Results and Discussion
나노버블 처리에 의한 용존산소 농도별 관수에 따른 한지형초종의 발아율은 발아실험에서 DAT 3일 이후 부터 그 차이가 나타났다(Table 2). 실험기간동안 대조군인 tap water와 10 mg L-1 간의 차이는 발생하지 않았으나, 20 mg L-1 이상의 용존산소 농도에서는 tap water와 10 mg L-1 처리구보다 5.5-11.3% 더 높은 발아율이 실험기간동안 나타났다. Tap water의 용존산소량이 6-8 mg L-1 인 것으로 고려할때 나노버블 처리에 의한 2-4 mg L-1 의 용존산소 농도의 차이는 본 실험결과 발아율에 있어서 유의차가 나타나지 않는 것으로 나타났다. 20과 30 mg L-1 간의 차이는 발아율에 있어서 실험기간 동안 발생하지 않았으며, 두 처리구가 발아율이 50%에 이르기까지 9일이 경과되는 것과는 대조적으로 tap water와 10 mg L-1 의 경우 처리후 18일이 되어야 발아율이 50%가 되는 것으로 나타났으며, 이 결과는 20 과 30 mg L-1 처리구 보다 2배의 시간을 걸리는 것으로 나타났다. Liu et al. (2016)은 나노버블에 의해 증가된 용존산소 농도를 포함한 수분을 barley (Hordeum vulgare)에 관수 했을때 증류수를 관수한 처리구보다 유의차를 나타내는 높은 발아율이 나타났다고 보고한 바 있으며, Lee et al. (2021)은 red mustard (Brassica juncea)에 나노버블에 의한 4가지 용존산소 농도를 적용한 실험에서 용존산소의 증가에 따라 red mustard의 발아율이 증가했다고 보고한 바 있어 본 연구 결과와 유사한 결과를 나타내었다. 발아율의 증가 원인으로는 나노버블에 의해 발생되는 반응성이 강한 활성산소 ROS (Reactive Oxygen Species, H2O2 or O2-)에 의한 것으로 판단된다. 적절한 활성산소 농도는 식물세포가 생장할 수 있도록 하는 세포벽 풀림요소(Cell wall loosening factor) 역할을 하거나 성장을 촉진시키는 신호분자 역할을 하게 된다(Ishibashi et al., 2010; Muller et al., 2009). Liu et al. (2016)은 나노버블의 주입량과 활성산소 농도가 양의 상관관계가 나타난다고 보고한 있으며, 동일 실험에서 나노버블 관수, H2O2 solution 그리고 증류수를 barley (Hordeum vulgare)에 처리한 비교실험에서 증류수 처리구 보다, 나노버블 관수와 H2O2 solution에서 더 높은 발아율이 나타났다고 보고한 바 있다. 그러나 많은 선행연구에서 보고된 바와 같이 활성산소가 필요 이상으로 생성될 경우 세포조직을 손상시켜 고사 혹은 병을 야기시키는 원인이 되기도 한다(Fridovich, 1986; Miquel, 1989). 또한 과도하게 높은 농도의 용존산소도 세포의 파괴 혹은 병을 야기시키는 원인이 되기도 한다(Bailly et al., 2008). Ikeura et al. (2017)의 실험에서는 나노버블에 의한 용존산소 15 mg L-1에서는 Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis)의 발아율이 증가되었으나, 21 mg L-1에서는 감소되었다고 보고 하였다. 본 실험에서는 나노버블에 의한 용존산소 농도 20 그리고 30 mg L-1 에서도 한지형 초종의 발아율이 증가한 것을 고려할 때 식물종에 따라 발아율에 긍정적인 효과를 나타내는 나노버블 의한 용존산소의 농도는 식물종 마다 그 적정범위에 차이가 있을 것으로 판단된다. 발아실험에서 나노버블에 의한 용존산소 농도별 발아율에 대한 효과는 30일 이후에는 나타나지 않았다.
Table 2
Mean cumulative percent germination for concentration of dissolved oxygen main effect in the growth chamber study.
한지형 초종간의 발아율의 유의차는 실험기간 동안 나타났다(Table 3). 많은 선행연구에서 보고된 바와 같이 초기 발아율은 PR에서 가장 높게 나타났으며, 실험 종료일 까지의 누적 발아율에서는 KB에서 가장 낮은 발아율이 나타났다(Franca et al., 1998; Frame, 1989; Hill and Michaelson-Yates, 1987). PR와 TF는 DAT 9 부터 유의차가 나타나지 않았다. 그러나 누적발아율이 50%가 되기까지 PR의 경우 약 6일이 소요되었으나, TF의 경우 동일 측정일에 PR과 유의차가 나타나는 47%로 나타났다. 선행연구에서 순수한 TF 종자가 50% 발아까지 4.2-7.1일 소요된다고 보고하고 있어, 본실험 결과는 선행연구와 유사한 결과가 나타났다(Dudeck and Peacock, 1986). 실험 종료일 PR 과 TF는 누적발아율이 95% 이상 되었으나, KB의 경우 42%로 나타났다.
필드실험에서는 DAT 36 부터 20 과 30 mg L-1 처리구에서 tap water 보다 높은 잔디피복률이 나타났다(Table 4). 이 결과는 발아실험에서 DAT 6 부터 20 과 30 mg L-1 처리구가 tap water 보다 높은 발아율을 나타낸 것과 약 30일의 차이가 있다. 식물생장상과 필드에서 수행된 실험에서 나타난 결과의 차이는 많은 선행연구에서 본 실험결과와 유사한 결과를 보고해 왔다(Hardegree and Van Vactor, 2000; Serena et al., 2010; Zhang et al., 2011). 선행연구의 결과와 같이 식물생장상 실험과 필드실험간의 차이는 온도, 습도, 광조건 등 다양한 환경조건이 차이가 있기 때문에 높은 상관관계가 나타났을지라도 식물생장상 실험결과로 필드실험 결과가 예측된다고 할 수 없다(Hardegree and Van Vactor, 2000). 특히 DAT 15-21 기간에는 강수량이 124.1 mm로 2022년 천안지역 연간 강수량의 7%가 이 기간에 나타났으며, 짧은 기간의 많은 강수량은 식물생장상 발아실험의 환경과 큰 차이를 나타나게 하는 원인이 되었다고 판단된다(weather data not shown). 따라서 본 실험에서 식물생장상 실험에서의 발아율과 필드실험에서 잔디피복율 결과의 차이는 실험환경의 차이에서 기인한 것으로 판단된다. 실험기간동안 잔디피복률에 대한 tap water와 10 mg L-1 간의 유의차는 발생되지 않았으며, 20과 30 mg L-1 간의 유의차도 나타나지 않았다. DAT 28 까지는 30 mg L-1 처리구와 tap water 처리구 간의 잔디피복율의 유의차가 나타나지 않았으나, DAT 36 부터는 용존산소 농도 20 mg L-1 이상의 처리구에서 tap water와 10 mg L-1 보다 높은 잔디피복률을 나타내었다. 잔디피복률에서 유의차가 나타난 최종 데이터 측정일인 DAT 42 에서는 20 mg L-1 이상의 처리구에서 tap water와 10 mg L-1 보다 11.1-13.9% 높은 잔디피복률을 나타내었다.
필드실험에서 한지형초종간의 잔디피복률의 차이는 실험기간동안 모두 나타났다 (Table 5). PR은 실험기간동안 가장 높은 잔디피복률을 나타냈으며, KB는 가장 낮은 잔디피복률을 나타냈다. 발아실험에서 PR과 TF간의 발아율에 대한 유의차가 DAT 9 부터 나타나지 않은 것과는 대조적으로 필드실험에서는 PR 과 TF 간의 잔디피복률의 유의차가 실험기간동안 나타났다. Kim et al. (2003) 은 초기 조성단계에서 3주차에 잔디피복도를 조사한 결과 발아속도가 가장 빠른 PR이 잔디피복도 5.0 (육안평가 1-9), TF는 4.5, KB는 2.0의 순으로 나타났다고 보고한바 있어 본 연구 필드실험의 DAT 21의 결과와 유사한 결과를 나타내었다. PR의 경우 DAT 15에서 잔디피복률이 50% 이상 나타났으며, TF는 DAT 36 에서 잔디피복률이 50% 이상 나타났다. KB의 경우 실험종료일의 잔디피복률은 44%로 나타났다.
발아실험과 필드실험을 통해 나노버블에 의한 용존산소 농도의 증가는 발아단계와 필드에서 초기 조성단계에서 긍정적인 효과가 있는 것으로 나타났다. 나노버블에 의해 용존산소가 20 mg L-1 이상인 경우에는 11.3% 더 높은 발아율을 나타냈으며, 9일만에 발아율이 50% 이상 나타났다. 필드실험에서는 36일부터 20 mg L-1 이상의 용존산소 농도 처리구에서 tap water 보다 높은 잔디 피복률이 나타났다. 나노버블에 의해 용존산소가 10 mg L-1 이 되는 경우 그 발아율이나 잔디피복률에서 tap water와 유의차가 나타나지 않은 것을 고려할 때 한지형잔디의 발아에서 초기조성단계에서는 20 mg L-1 이상의 용존산소 농도가 긍정적인 영향을 주는 것으로 판단된다. 그러나 30 mg L-1 이상의 농도에서는 일부 부정적인 요인이 될 수 있어 30 mg L-1 이상의 농도 적용을 위해서는 초종에 따라 나노버블에 의한 높은 용존산소 농도별 효과의 연구가 필요하다고 판단된다.
Table 3
Mean cumulative percent germination for cool-season species main effect in the growth chamber study.
요 약
나노버블이란 액체 내부에 기체가 분산되어 발생한 기포로 직경의 크기가 200 nm 이하인것을 의미하며, 나노버블에 의한 용존산소의 증가는 식물의 성장촉진과 발아속도 향상 등에 효과가 연구결과를 통해 지속적으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 나노버블에 의한 용존산소 농도가 한지형잔디 초종의 발아와 초기조성에 어떤 효과를 나타내는지 검증하기 위해서 수행되었다. 한지형잔디 초종 Kentucky bluegrass 'Endurance', Perennial ryegrass 'Gray Fox', Tall fescue 'Rising Moon' 이 사용되었으며, 나노버블에 의한 용존산소 농도는 10, 20, 30 mg L-1 그리고 tap water가 사용되었다. 나노버블에 의한 용존산소가 20 mg L-1 이상인 경우에는 tap water 처리구보다 11.3% 더 높은 발아율을 나타냈으며, 9일만에 발아율이 50% 이상 나타났다. 필드실험에서는 20 mg L-1 이상의 용존산소가 36일 부터 tap water 보다 11.1-13.9% 높은 잔디피복률을 나타내었다. 본 실험에서 발아실험과 필드실험을 통해 나노버블에 의한 용존산소 농도 20 mg L-1 이상은 발아를 촉진시키고 필드에서 초기 조성단계에서 피복률 증가에 긍정적인 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나 30 mg L-1 이상의 고농도에서는 부정적인 효과 여부를 검증하기 위해 더 많은 연구결과가 요구된다.
