서론
GM (genetically modified, 유전자변형) 작물의 개발과 이용은 지속적으로 증가되고있으며, 2017년에만 24개국 1억 8,980만 헥타르의 면적에서 재배되었다(James, 2018). GM 작물 중 유채(Brassica napus L.)는 콩, 옥수수, 면화에 이어 전세계적으로 네번째로 많이 재배되는 작물로 2017년 기준으로 1,020만 헥타르에서 재배되어 전체 GM 작물의 5%를 차지하였다. GM 유채는 캐나다, 미국, 호주, 칠레에서 재배되었으며, 전 세계 유채 재배 면적인 3,370만 헥타르의 30%를 차지하고 있다(James, 2018). 아직 국내에는 상업화된 GM 유채는 없으나 식용 및 사료용으로 14종의 이벤트가 수입 승인되었다(KBCH, 2019).
GM 작물은 실용화를 위해 안전성평가가 필수 요소이며, 특히 화분에 의한 GM 작물 도입유전자의 이동성평가는 환경위해성 평가에서 가장 중요한 요소 중 하나이다. GM 작물의 교잡에 의한 도입 유전자의 이동은 격리포장 실험에서 안전거리 설정에 있어 가장 중요한 요소 중 하나이다. GM 작물 도입 유전자가 야생종으로 이동할 경우 잡초화를 통한 환경생태계에 영향을 미칠 가능성이 있으며, GM 작물의 상업화 후 재배종으로의 유전자이동은 일반 재배농가와의 공존문제를 야기할 수 있다(Devos et al., 2004; Halfhill et al., 2002). 유채는 AA 게놈인 Brassica rapa와 CC 게놈인 Brassica oleracea에서 파생된 복이배체로서 AACC 게놈을 가지며 유전적 친화성으로 인해 B. rapa, B. oleraceae, Brassica juncea 등과 교잡이 가능하고 이에 속한 다양한 작물 및 잡초와 교잡이 가능한 것으로 알려져 있다(OECD, 2012). 국내에도 유채와 교잡 가능한 다양한 배추, 순무 등 재배종과 갓 등 야생종 십자화과 식물이 다수 분포하고 있으며, 이들 십자화과 작물들은 타가수분율이 높고 대부분 교잡 가능하여 GM 유채의 도입형질이 전달될 가능성이 높다. 유채의 교잡은 화분 이동을 통해 발생하며 화분 이동은 주로 바람과 매개충에 의한 발생된다. Lavigne et al. (1998)은 재배포장에서 유채의 화분은 바람에 의해 대량 확산되며 3 m 거리에서 50% 이내로 화분 이동이 감소되고 약 10 m 거리에서 대부분의 이동이 감소된다고 밝혔다. 다른 연구에서 유채 화분은 20 m까지 비산되며 이 거리에서 화분원 근처에 비해 화분양이 90% 감소된다고 보고하였고(McCartney and Lacey, 1991), Timmons et al. (1995)은 360 m의 먼 거리까지 화분이 이동하며 그때 화분의 양은 화분원 근체의 10% 정도라고 밝혔다. 유채의 화분 비산에 대한 다양한 연구결과들을 종합해보면 화분의 이동은 화분 공급원으로부터 거리가 멀어질수록 화분의 양이 급격히 감소하는 경향을 나타내며 약 50 m의 거리에서 이종교배 비율이 0.5% 이하로 떨어지는 것을 알 수 있다(OECD, 2012). 유채는 꿀벌과 일부 딱정벌레 등 곤충에 의한 화분 확산도 가능하며 많은 연구에서 꿀벌이 주요매채충으로 알려져 있다. 꿀벌은 화분 공여체와 수용체의 거리가 멀 때 바람에 의한 화분 이동보다 더 효과적이다. 꿀벌은 5 m 이상 화분 매개가 가능한 것으로 보고되어 있으며 어떤 연구에서는 2 km 이상의 거리까지 화분을 매개하는 것으로 보고되었다(Cresswell, 1994; Pierre, 2001; Timmons et al., 1996).
유채의 화분 이동성은 생산지역과 환경, 기후 등에 의해 영향을 받는다(Ramsay et al., 2003). 식물의 원원종(foundation seed) 생산은 순계 유지를 위해 교잡을 방지해야 하는데, 미국 종자공인기관협회(Association of Seed Certifying Agencies)는 유채의 원원종(foundation seed) 생산 시 교잡 방지를 위해 격리 거리를 400 m로 규정하고 있다. 일본에서는 GM 작물의 환경방출과 관련하여 유채 교잡 방지를 위해 격리거리를 600 m로 지정하고 있으며, 중국 농업부는 GM 유채 격리거리를 1,000 m로 규정 하고 있다. 국내에서는 종자관리요강에서 유채 원원종(foundation)은 격리거리 없이 망실재배만을 원칙으로 하고 있으며 원종(registered seed)은 1,000 m를 격리거리로 하고 있다(Lee, 2017). 국내에서는 GM 유채에 대한 재배는 수행되고 있지 않지만 GM 유채에 대한 연구는 지속적으로 진행되고 있다. 유체에 대해 전 세계적으로 농업형질 및 생산성 증대, 기름 및 박의 품질 향상, 질병/해충 저항성에 대해 연구가 진행되어 왔으며, 최근에는 불포화 지방산 성분을 높여 오메가-3를 생산하는 연구가 진행되고 있다(KBCH, 2019). 국내에서는 대학 및 국공립연구소, 기업 등에서 제초제저항성, 해충저항성, 토코페놀 및 바이오연료 생산 등의 형질에 대한 기능을 가진 배추, 유채 등 십자화과 작물이 개발 중에 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 생물 및 비생물 스트레스 저항성, 기능성 등 GM 배추가 연구개발중인 것으로 알려져 있다(Park et al., 2018).
개발중인 GM 유채의 상업화를 위해서는 안전성평가 기술 확립이 필요하다. 유채의 경우 화분 비산거리가 비교적 멀고 벌 등 매개충에 의한 화분 이동이 가능하며, 야생종과 이종교배가 가능하여 유전자이동에 대한 높은 안전성평가 기술이 요구되는 실정이나 야외포장에서의 교잡 연구는 국내외적으로 많이 수행되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 대규모 면적에서 유채 도입유전자의 유전자이동성 평가 기술을 개발하고 유전자이동 격리거리 설정 등을 통한 국내 안전관리 체계 확립을 위해 제초제저항성 유채를 이용하여 유채와 교잡 가능성이 높은 국내 주요 재배종 및 야생종 식물인 배추(B. rapa subsp. pekinensis), 순무(B. rapa subsp. rapa), 갓(B. juncea)으로의 화분 이동성을 조사하였다.
재료 및 방법
실험재료
유전자이동성 연구를 위해 imidazolinone 제초제저항성 유채(Brassica napus)를 화분 공여체로 사용하였으며, 화분 수용체로 배추(B. rapa subsp. pekinensis)와 순무(B. rapa subsp. rapa, 영문이름 turnip), 갓(B. juncea) 등 3종의 십자화과 식물을 사용하였다. 제초제저항성 유채는 University of Idaho에서 분양 받았으며, 배추는 Michihili, O.P. 품종으로 Treasure Valley, Idaho에서 2012년 수확된 품종이었다. 순무는 Willamette Valley, Oregon에서 2014년 수확된 Purple Top White Globe, O.P. 품종이며, 갓은 Idaho에서 수확된 Pacific Gold 품종을 사용하였다.
실험구 설계 및 샘플링
유채의 유전자 이동성 실험 포장은 미국 오레곤주립대학(Oregon State University)의 야외포장 중 하나인 Hyslop Crop Science Field Research Laboratory (3455 NE Granger Ave, North Benton, OR, USA)에서 수행되었으며, 포장 크기는 가로 185.9 m, 세로 97.5 m이었다. 화분 공급원인 제초제저항성 유채는 2014년 9월에 파종하였으며, 한면의 길이가 15.24 m인 총 면적 약 684 m2의 육각형 모양으로 배치하였다(Fig. 1). 종자 파종은 0.56 g/m2 (5 lb/acre)의 파종량으로 하여 기계 파종하였다. 화분 수용체인 배추와 순무, 갓은 제초제저항성 유채를 중심으로 북동, 남동, 남서, 북서 등 4방향으로 배치하였으며 각 식물 당 3.65 m 넓이로 79.25 m 거리까지 배치하였으며 파종은 유채와 동일한 파종량으로 기계 파종하였다(Fig. 1). 화분 수용체 식물의 파종 시기는 유채와 개화기를 일치시키기 위해
순무의 경우 2014년 9월에 파종하였고 배추와 갓은 2014년 10월에 파종하였다.
제초제저항성 유채와 화분 수용체 식물들의 꽃이 핀 개체가 40-50% 정도에 달한 날을 기준으로 개화기를 산정하였다. 화분 수용체 식물에서 교잡 종자의 수집은 결실기에 맞춰 수행했으며 배추의 경우 2015년 5월 28일, 순무는 6월 11일, 갓은 6월 16일에 수행되었다. 샘플 수집은 화분 공여체인 제초제저항성 유채로부터 3.05 m (10 ft.) 간격으로 26개 지점에서 샘플링되었고, 북동, 남동, 남서, 북서 등 각각 4 방향에서 수행되었다. 샘플링을 위한 종자 수확은 종자 꼬투리가 달려있는 식물체의 위에서 50 cm 부위까지 잘라내었으며, 수확된 식물체는 비닐백에 담아 건조를 위해 온실로 운송하였다. 수확된 샘플은 온실에서 약 3주간 건조과정을 진행시켰으며 이후 손 타작과 종자 정선을 수행하였다.유전자이동성 조사
유전자이동성 조사는 제초제 선발을 통해 수행되었으며, 제초제 선발 실험을 위해 먼저 발아율 분석을 수행하였다. 화분 수용체 식물로부터 수집된 종자를 원예용 상토가 담긴 480 cm×380 cm×80 cm 크기의 플라스틱 상자에 유채, 배추, 순무, 갓의 각 종자 50립을 파종 후 5일 뒤 발아된 개체를 확인하였다. 발아 분석 실험은 3반복으로 수행되었다.
교잡율 분석을 위한 제초제 선발은 농촌진흥청 농업생명자원부 야외 포장 내 온실에서 수행되었다. 500개의 종자를 480 cm × 380 cm × 80 cm 크기의 플라스틱 상자에 파종 후 2일 후에 160 μL/20 mL 농도의 이마자퀸(imazaquin) 제초제를 150 mL의 양으로 살포하였다. 제초제 처리 후 약 3주 뒤 제초제에 저항성인 개체를 조사하였다. PCR 검정은 제초제에 저항성을 나타낸 식물 샘플의 잎 100 mg을 액체질소와 유발을 이용하여 곱게 갈은 후 QIAGEN사의 DNeasy PowerPlant Pro Kit를 이용하여 매뉴얼에 따라 DNA를 추출하였다. PCR에 사용된 마커는 유채 부본 탐색을 위한 염색체 C genome primer를 이용하였으며, primer 정보는 F-ATTATGACGCCTGGTTTTA, R-ATTGGTTAGAAGTTATGGGAAC이었다. PCR 반응의 조성은 1.5 μL의 분석시료 genomic DNA (50 ng), 30 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 μM dNTPs, Taq polymerase 1U, 각 1 μL의 primer를 포함하여 총량은 20 μL이었다. PCR 반응 조건은 95℃ 5분 후, 95℃ 30초 및 55℃ 30초, 72℃ 1분의 조건에서 35 사이클로 증폭한 뒤 72℃에서 5분간 처리하여 완료하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후 확인하였다.
결과 및 고찰
유채는 바람 및 벌과 같은 매개충에 의해 화분확산이 가능하며 특히 벌에 의해 먼 거리까지 유전자가 이동되는 것으로 보고되어 있다(OECD, 2012). 국내에서 향후 GM 유채 상용화에 대비하여 유전자 이동성에 대한 안전관리 체계 확립이 요구되는 실정이나 기존 국내에서 수행된 십자화과 작물의 유전자 이동성 연구는 온실 면적 수준에서만 수행되었으며(Kim et al., 2014; Lee et al., 2009), 이는 실험포장면적에 대한 국내 인프라 부족 및 GM 작물의 유전자 확산에 따른 유전자 오염에 대한 제약 때문일 것으로 판단된다. 본 연구에서는 포장재배 면적 단위에서 유채로부터 다른 십자화과 작물로의 유전자 이동성을 조사하기 위해 가로 185.9 m, 세로 95.7 m의 대규모 포장 면적에서 실험을 수행하였다. 화분 공여체로는 imidazolinone 제초제에 저항성을 가진 유채를 사용하였다. 이 제초제저항성 유채는 유전자변형을 통한 형질전환이 아닌 enzyme acetohydroxyacid synthase 유전자에 돌연변이를 유도시켜 저항성 형질을 나타내는 non-GM 유채로 Clearfield라는 상품명으로 상업화 된 품종이다(Tan et al., 2005). 화분 공급원으로 제초제 저항성 유채를 684 m2의 면적으로 육각형 모양으로 배치하였으며, 화분 수용체인 배추(Chinese cabbage)와 순무(turnip), 갓(leaf mustard)을 제초제저항성 유채를 중심으로 북동, 남동, 남서, 북서 등 4방향으로 배치하였다. 본 실험에서는 일반 재배 조건에서의 유채 화분의 이동성 확인을 목표로 했기 때문에 식물을 개체 단위로 심지 않고 파종기를 이용해 기계파종 하였다(Fig. 1).
Fig. 1. An experimental design of the field trial. The herbicide resistance (HR) canola was planted in center as a pollen donor (black hexagon). The leaf mustard (white square), turnip (spotted square), and Chinese cabbage (gray square) were planted in a line as pollen receivers in each of the four directions
화분을 통한 유전자이동성에서 가장 중요한 사항은 작물 간 개화기의 일치이다. 이를 위해 시험 작물들의 생육과 개화기를 조사한 결과 제초제저항성 유채의 개화 시작은 2015년 3월 2째 주 있었으며, 순무는 3월 2째 주로 유채와 유사하였고, 갓은 유채에 비해 1주 늦은 3월 3째 주였다. 배추의 경우 개화시기가 유채에 비해 3주 정도 이른 2월 3째 주었다. 개화는 모든 작물에서 약 3개월 정도 지속되어 작물 간 개화기는 2달 이상 일치되었다.
교잡 분석을 위한 종자 시료는 화분 수용체 식물의 4개 방향에서 모두 수집되었으며 거리 별로 26개 지점에서 시료를 수집하였다. 유전자이동성 분석은 발아된 종자에 제초제를 처리하여 생존한 개체를 조사하여 수행하였다. 제초제저항성 분석을 위해 각 작물의 평균 발아율을 조사한 결과 유채는 95.3±2.5% 이었으며, 배추는 94.7±1.9%, 순무는 92.0±5.9%로 유사했으며, 갓은 77.3±4.1%로 비교적 낮은 발아율을 보였다. 제초제 선발 시험을 위해 제초제 민감도 테스트가 수행되었다. 사용된 제초제는 이미다졸리닌(imidazolidine) 계열의 이마자퀸 액제(상품명)를 사용하였다. 민감도 테스트는 표준약량을 기준으로하여 200 mL 당 120 μL부터 400 μL까지 다양한 농도에서 이뤄졌으며, 160 μL/200 mL의 농도에서 가장 우수한 선발력을 보여 이후 제초제 선발실험에 사용하였다(Fig. 2).
교잡종 분석을 위한 제초제 선발은 격리포장 내 비닐온실에서 수행되었다. 500개의 종자를 480 cm × 380 cm × 80 cm 크기의 플라스틱 상자에 파종 후 3일 간 발아를 유도한 후에 160 μL/200 mL 농도의 이마자퀸 제초제를 한 상자 당 150 mL의 양으로 살포하였다. 제초제 처리 후 3주 뒤 제초제에 저항성인 개체를 조사하였다. 제초제에 저항성을 나타낸 개체는 잎을 채집하여 DNA를 추출한 뒤 PCR 분석으로 검정을 수행하였다. PCR에 사용된 DNA 판별 마커는 Louarn et al. (2007)이 보고한 양배추(CC 게놈)의 microsatellite 마커 중 실험에 적합한 C 게놈 특이적 프라이머 조합을 선발하였다. 해당 마커는 C 게놈을 특이적으로 증폭(약 250 bp)하는 특징이 있어 AACC genome을 지닌 유채에서는 PCR 산물이 증폭되나 배추, 순무 (AA 게놈)와 갓(AABB 게놈)에서는 PCR 증폭 산물이 발생되지 않는다(Fig. 3). 제초제 저항성을 나타낸 화분수용체 배추, 순무, 갓에서 PCR 증폭 밴드가 확인되는 경우 유채로부터 교잡이 발생한 것으로 확정하였다.
배추, 갓, 순무 등 각 작물의 거리별 지점 당 500립씩 총 53,000립의 종자에 대해 제초제 선발과 PCR 분석을 수행하였다. PCR 분석 결과 배추에서는 총 8개의 교잡종이 발견되었으며, 순무에서는 총 5개의 교잡종이 발견되었다(table 1). 갓에서는 60개의 제초제에 약한 저항성을 보이는 개체를 확인했으나 PCR 분석결과 교잡종은 발견되지 않았다. 최종 확인된 교잡 개체는 분석 결과 방향에 대한 차이를 보이지 않았으며 개체수가 적어 방향 별 결과를 합하여 거리별로 교잡율를 구하였다. 배추의 경우 화분원으로부터 가까운 거리인 0-6.1 m의 거리에서 0.083%의 교잡율 나타냈으며, 9.15-15.25 m의 거리에서는 0.033%의 교잡율을 보였다. 18.3-61.0 m의 거리에서는 교잡 개체가 발견되지 않았으나 64.05 m에서 1개의 교잡 개체가 확인되었다. 순무의 경우 화분원으로부터 0-6.1 m 거리의 가까운 거리에서 0.067%의 교잡율 나타냈으나 9.15-27.5 m의 거리에서는 교잡 개체가 발견되지 않아 배추에 비해 낮은 교잡율을 보였다.
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Table 1. Number of hybrid progenies and frequency of out-crossing rates in Chinese cabbage and turnip. 
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야외포장에서 유채 간의 타식율(outcrossing rate)은 10-50%로 알려져 있으며(OGTR, 2002), 30-60 m 거리에서의 유채 간의 교잡율은 0-0.0003% (Scheffler et al., 1993), 0.022% (Manasse and Kareiva., 1991), 0.02% (Staniland et al., 2000), 0.33% (Ramsay et al., 2003) 등 다양한 연구 결과가 보고되어 있다. 유채로부터 B. rapa 등 교잡가능한 십자화과 작물로의 유전자이동성에 대해서는 유채-유채 간 이동에 비해 많은 연구가 수행되진 않았다. Jenkins et al. (2001)은 유채로부터 B. rapa 종인 순무(turnip)로 유전자이동이 hand pollination으로는 100% 교잡율을 보였지만, 야외 포장에서는 1.5 m 이내 거리 실험에서 유채와 순무의 비율을 1:400으로 하였을 때 0.06% (1998년) 및 2.13% (1999년)의 교잡율을 나타냈다고 보고하였다.
갓은 중국, 러시아, 캐나다 등 국가에서는 기름과 조미료를 위한 작물로 재배되지만 유럽과 호주 등 국가에서는 잡초로 간주된다. 갓은 AABB 게놈을 가지고 있어 AACC 게놈을 가진 유채와 공통의 유전자를 가지고 있어 이종교배 확률이 높다(OECD, 2012). 유채로부터 갓으로의 유전자이동에 관한 연구에서 Warwick (2007)는 유채 포장으로부터 갓 포장으로 유채 유전자의 교잡율이 인접하였을 때 0.245% 이었으며, 50 m 거리에서는 0.030%, 100 m 거리에서는 0.021%이었다고 보고하여 화분 공여체와 수용체의 거리에 따라 교잡율이 급격히 감소함을 알 수 있었다. 이러한 교잡율은 화분수용체의 개체 수가 증가함에 따라 감소된다. Jøergensen et al. (1998)은 유채로부터 갓으로의 유전자이동 연구에서 유채, 갓의 비율이 1:3에서 1:15로 증가됨에 따라 교잡율이 2.3%에서 0.3%로 감소했다고 보고했다.
본 연구에서 유채로부터 갓으로의 유전자이동성은 관찰되지 않았으며, 유채로부터 배추, 순무로의 유전자 이동은 기존 연구 결과에 비해 유사하거나 낮게 조사되었다. 이러한 이유는 기존 연구에서 교잡 확인을 용이하게 하기 위해 화분 수용체 식물을 화분원에 비해 적게 배치한 반면 본 실험에서는 일반 재배 환경 조건에서의 유전자 이동성 조사를 목적으로 실험을 설계하여 배추, 순무, 갓을 밀식 재배함으로 근접한 화분수용체 간에 타가수분이 우선하여 발생했을 가능성이 높다고 사료되었다. 따라서 식물이 재배되는 환경에서의 유전자 이동성은 기존 보고된 실험 환경에 비해 교잡율이 낮을 것으로 사료된다. 또한 국내에서 배추나 순무의 경우 재배되더라도 개화 전에 수확하기 때문에 GM 유채가 비의도적으로 방출되어도 배추나 순무와 교잡할 가능성은 매우 낮을 것으로 판단된다. 하지만 식물 간의 유전자 이동은 개화기, 재배환경, 선발 방법 등 다양한 요인들이 관여하기 때문에 이들의 영향을 배제할 순 없다. 이번 연구에서 먼 거리에서의 교잡종은 순무의 경우 30.5 m에서 1개체, 배추의 경우 64.05 m에서 1개체씩 발견되었다. 이들 먼 거리의 경우 벌과 같은 충매의 가능성이 높은 것으로 사료되었다. 이러한 결과는 GM 유채의 환경방출 실험에서 먼 거리의 충매 이동성에 대한 관리가 요구됨을 시사한다.
국내에서 취약한 십자화과 GM작물의 대규모 유전자이동성 평가 경험의 축적과 이를 통한 국가 안전관리 및 안전성평가를 위한 관련 기술 개발이 필요하며, 국내 GM유채의 환경생태계 방출에 대한 모니터링 및 위해성 분석 기술 개발이 요구되는 실정이다. 국내의 주요 채소 작물인 배추에 대해 야외포장 조건에서 유채로부터의 유전자 이동성 조사는 국내외 적으로 거의 수행되지 않아 본 연구가 유일한 것으로 판단된다. 본 연구에서는 국내에서 유전자변형 유채의 시험연구 및 상업적 재배 시 유채로부터 교잡 가능한 이종으로의 교잡 거리 및 빈도를 조사함으로 향후 안전관리 수립의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
