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제초제 개발을 위해서는 무작위 유기합성된 제초활성물질을 스크리닝하는 방법(random screening), 기존에 개발되어 있는 제초제의 구조를 모방하는 방법(me-too), 작용점 저해 화합물을 컴퓨터를 이용하여 설계하고 고활성의 제초활성물질을 합성하는 생합리적 방법(rational designing), 그리고 천연물로부터 제초활성물질을 탐색하는 방법을 들 수 있다(Duke et al., 2000). 국내에서 신규로 개발된 flucetosulfuron (플럭소; Kim et al., 2006), metamifop (피제로; Cooper et al., 2016), methiozolin (포아박사; Koo et al., 2013), tiafenacil (테라도; Park et al., 2018)와 같은 제초제들은 모두 기존에 개발되어 있는 제초제의 구조를 모방하는 me-too 방법을 차용하였기에 기개발된 제초제들과 비교하여 화학구조와 작용점, 생리활성 등에서 특별한 차별성이 부각되지 못하고 있는 실정이다.
저자들은 한국의 자생식물로부터 제초제 개발을 위한 모화합물을 탐색하려는 노력을 지난 2003년부터 현재까지 진행하고 있으며, 지금까지 국내의 자생식물 1,500여종으로부터 기존에 보고되지 않은 식물생장억제물질을 발견하였다. 할미꽃(Pulsatilla koreana L.)으로부터 anemonin (Choi et al., 2003), 5,6,7-trimethoxy coumarin (Choi et al., 2008), 삼지구엽초(Epimedium koeanum Nakai)로부터 methyl-p-hydorxybenzoate (Lim et al., 2007), 애기수영(Rumex acetosella L.)으로부터 chrysophanic acid (Kim et al., 2003), 족도리풀(Asarum sieboldii Miq.)로부터 elemicin (Kim et al., 2005), 그리고 소리쟁이(Rumex cripspus L.)로부터 angelicin (Cho et al., 2010)을 분리동정하여 새로운 제초제 개발을 위한 모화합물로 제공하였다. 그러나 저자들의 발견과 아이디어가 산업체에서 새로운 제초제 개발단계로까지 진전된 사례는 아직 없는 실정이다. 그러나 bottle brush plant (Callistemon citrinus)로부터 분리된 leptospermone (Mitchell et al., 2001)이 tyrosine으로부터 plastoquinone과 α-tocophenol을 생성하는 생화학 과정에 관여하는 효소인 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD)를 저해하는 제초제인 mesotrione으로 개발된 사례를 고려해보면 저자들이 국내 자생식물로부터 분리한 신규의 식물생장억제물질은 국내 산업체의 개발 의지와 노력을 배가하면 새로운 작용기전을 갖는 제초제를 개발할 수 있을 것이다.
저자들이 탐색한 식물생장억제물질은 in vitro 실험과 온실실험 단계에만 머물러 있을뿐 제초제 개발까지는 많은 단계의 연구가 남아 있다. 저자들은 2021년 국내 전역으로부터 한국자생식물 60종을 수집하여 methanol (MeOH)로 추출하여 추출물을 유채(Brassica napus L.)를 대상으로 식물생장억제효과를 검정한 결과, 가중나무(Ailantus altissima Swinggle) 추출물이 in vitro 실험과 온실시험에서 식물생장 억제효과가 있음을 확인하였고, 용매분획과 컬럼크로마토그래피로 식물생장억제물질을 분리하였다. 그리고 단리된 분획물을 핵자기공명 분광분석법(1H-/13C-nuclear magnetic resonance, NMR)과 기체크로마토그래피 질량분석법(gsa chromatography-mass spectometry, GC-MS)으로 화학구조를 동정하여 신규의 식물생장억제효과를 발견하였기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
식물시료
전라북도 전주시 인근의 야산(35o45'08''N, 12712'19''E)에서 1995년 7월 식물 분류 및 동정 후 가중나무 잎 부위를 5 kg 수확하였다. 수확된 시료를 상온에서 음건한 후 분쇄기(HMF-3260S, HANIL, Seoul, Korea)를 이용하여 세절하였고 메탄올(methanol, MeOH) 추출에 이용하였다.
MeOH 추출
가중나무 잎 시료 150 g을 3-L 삼각플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣고 MeOH 1.8 L를 첨가한 후 220 rpm 조건의 교반기에서 24시간 교반하면서 2회 반복 추출하고, 두 추출물을 합쳐 하나의 시료로 만들었다. 잔재물을 제거하기 위해 Whatman NO. 2 여과지가 깔려 있는 부흐너 깔때기(Büchner funnel)를 통과시켜 여과한 다음 회전감압농축기(NE-1101, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃, 120 bar 조건에서 농축하였다. 완전 농축된 MeOH 추출물을 1 L의 증류수를 이용하여 용해시킨 후 -4℃의 냉동고에서 24시간동안 냉동시키고 동결건조기(ILSHIN Lab Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 7일간 건조시켜 MeOH 추출건조물을 만들었다. 이를 -20℃의 냉동고에서 보관하면서 제초활성검정(in vitro seed bioassay, greenhouse experiment)과 제초활성물질 분리에 사용하였다.
MeOH 추출건조물의 용매 분획
가중나무 MeOH 추출건조물 20 g을 700 mL의 증류수로 현탁시킨 다음 헥산(hexane; Hex), 디클로로메탄(dicholoromethane; CH2Cl2), 에틸아세테이트(ethylacetate; EtOAc), 부탄올(buthanol; BuOH), 물(d-H2O)의 순서로 순차적으로 용매의 극성을 높여가면서 분획하였다. 무수 황산나트륨(anhydrous sodium sulfate) 100 g이 충진되어 있는 100 mL 깔대기에 용매 분획물을 통과시켜 수분을 제거하였고, 용매분획물을 회전감압농축기를 이용하여 농축시켰다. 농축된 각각의 용매분획물을 동결건조기에서 7일간 건조시킨 후 -20℃의 냉동고에서 보관하면서 제초활성검정과 제초활성물질 분리에 사용하였다.
제초활성검정
in vitro Seed bioassay
각각의 용매분획물을 증류수로 희석하여 10,000 mg L-1의 stock solution을 제조하였고, stock solution에 증류수를 첨가하여 0, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000 mg L-1의 처리액을 만들었다. 24-well tissue culture plate(SPL Life Science, Pocheon, Korea)의 각 well에 sea sand 1 g을 넣고 5립의 유채종자(Brassica napus L.)를 치상한 다음 처리액을 1 mL식 첨가하였다. Tissue culture plate를 온도 26/23℃ (낮/밤), 상대습도 50%, 광도 3,000 Lux, 광주기 16/8 시간(낮/밤) 조건의 식물생장상(DF-95G-700M, DURI Science lnc., Wonju, Korea)에서 7일간 넣고 유채를 생육시켰다. 생육된 유채 유식물의 생체중을 측정하여 처리-약량 반응곡선(dose response curve)을 구하였고, 이를 바탕으로 식물의 생장을 50% 저해할 수 있는 약량인 GR50 (growth retardation 50%)값을 산출하였다.
Greenhouse experiment
MeOH 추출물의 제초활성은 한국화학연구원에서 검정하였다. MeOH 추출물 처리액 0, 5,000, 10,000 ppm을 미국개기장(Panicum dichotomiflorum), 바랭이(Digitaria ciliaris), 수수(Sorghum bicolor), 돌피(Echinochloa crus-galli), 개밀(Agropyron tsukushiense), 까마중(Solanum nigrum), 자귀풀(Aeschynomene indica), 어저귀(Abutilon theophrasti), 도꼬마리(Xanthium strumarium), 메꽃(Calystegia japonica)의 2-2.5엽기 경엽에 처리하였다.
가중나무 EtOAc 분획물의 분리
가중나무 용매분획물 중 제초활성이 가장 높았던 EtOAc (EA) 분획물로부터 제초활성물질을 분리하였다. EtOAc 분획물로부터 제초활성물질을 분리하기 위하여 먼저 thin layer chromatography (TLC)를 수행하였다. 유리 모세관을 이용하여 TLC plate (Silicagel 60 F254, Merck, Darmstadt, Germany)에 EtOAc 분획물을 점적처리하고, 드라이어를 이용하여 건조시킨 다음 TLC plate를 전개용매(EtOAc:CH2Cl2:MeOH=5:5:2, v/v/v)가 1 mL가 담겨 있는 TLC chamber (4×4 cm)에 넣고 전개시켰다. 전개가 끝난 TLC plate를 TLC chamber로부터 꺼내어 드라이어를 이용하여 건조시킨 다음 휴대용 UV lamp (파장 256 nm) 하에서 5개의 spots를 확인하였다: EA (Rf, 0.975), EB (Rf, 0.675), EC (Rf, 0.575), ED (Rf, 0.275), EE (Rf, 0.0).
고정상 Silicagel 60 (0.040-0.063 mm, Merck, Darmstadt, Germany) 2 kg이 충진되어 있는 크로마토그래피용 컬럼에 전개용매를 2.5 L 흘려주어 습식충진하였다. 전개용매(EtOAc:CH2Cl2:MeOH=5:5:2, v/v/v) 15 mL에 EtOAc 분획물을 용해시킨 다음 그 처리액을 컬럼의 표면에 균일하게 흡착시켰으며, 흡착과 동시에 전개용매를 충진시켜 분당 4 mL씩 용출시켰다. 컬럼의 아래에 10-mL 시험관을 놓고 test tube 당 8 mL씩 받아 분리하였으며 각각의 test tube에 담겨 있는 용출액을 TLC plate에 전개시켜 spots를 확인하였다. 동일한 spot으로 확인된 test tube의 용출액을 모은 후 회전감압농축기에서 농축하고 d-H2O로 현탁시켰다. 현탁액을 동결건조시킨 후 in vitro 제초활성검정을 수행하였다.
EAC 분획물에 함유된 제초활성물질의 검정
EA 분획물로부터 분리된 5개의 분리물 중 EAC 분획물의 제초활성이 가장 높았기에 EAC 분획물이 단일물질인지를 확인하기 위하여 Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)를 이용하여 분석하였다. 이를 위하여 사용된 GC-MS의 분석조건은 Table 1에 나타내었다.
Table 1. Analytical conditions of gas chromatogrphy-mass spectormetry for Ailantus altissima Swinggle.
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GC 분석조건은 50℃에서 5분간 유지하고, 분당 4℃씩 250℃까지 승온시킨 다음 10분간 유지시켰으며, carrier gas는 헬륨(He)이었고 유속은 1 mL min-1이었다. 분석에 사용된 GC는 HP-5MS fused-silica capilary column (30×0.32 mm, 0.25 μm)이 장착되어 있는 Agilent 7890A (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)이었으며, MS는 5975C MSD (Agilent Technologies)이었다.
MS의 분석조건은 ionization voltage가 70 eV, 이온소스 온도는 280℃이었으며 splitless mode이었다. MS 성분분석은 Wiley 275와 NIST library mass spectrum data를 이용하여 확인하였다.
가중나무 유래 제초활성물질 EAC 분획물의 화학구조 동정
가중나무로부터 분리한 EAC 분획물의 화학구조 동정을 위해 1H-NMR (600 MHz Bruker Advance II), 13C-NMR (600 MHz Bruker Advance II)을 이용하였으며, 용매는 acetone을 사용하였다. 내부표준물질로는 tetramethylsilane (SigmaAldrich, St. Louis, USA)을 사용하였다.
Glycine betaine의 제초활성검정
가중나무 EAC 분획물인 glycine betaine의 제초활성을 검정하기 위하여 유채종자를 이용하여 in vitro 제초활성을 검정하였다. Glycine betaine은 SigmaAldrich 사(61962, St. Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
결과 및 고찰
가중나무 MeOH 추출물의 유채에 대한 생장억제효과(in vitro bioassay)
가중나무 MeOH 추출물은 in vitro실험에서 유채 유식물의 생체중의 증가를 억제한 효과는 나타내었다(Fig. 1). 가중나무 MeOH 추출물 2,000 μg g-1처리구부터 유채 생장은 저해되었으며, 4,000 μg g-1처리구부터는 식물생장 억제 효과가 거의 일정하게 나타났다. 가중나무 MeOH 추출물의 농도에 따른 생장억제 추세선에 의하면 유채 식물의 생장을 50% 억제하는 약량(GR50값)은 2,132 μg g-1으로 계산되었다(y=2E-06x2-0.0226x+89.099, R2=0.8648).
Fig. 1. Grwoth retardation curve of Brassica napus L. seedlings by treatment of the MeOH extract of Ailantus altissima Swinggle in vitro experiment. The regression formula based on the experimental data is y=2E-06x2-0.0226x+89.099 and the calculated growth retardation 50% (GR50) value of MeOH extracts of Ailanthis altissima Swinggle to Brassica napus L. is 2,132 μg g-1. Date, means and Ailanthis altissima Swinggle.
가중나무 MeOH 추출물은 온실시험에서도 생장억제 효과를 나타내었는데, 한국화학연구원에서 수행한 예비 실험 결과에 따르면, 가중나무 MeOH 추출물 5,000 μg g-1과 10,000 μg g-1을 식물의 경엽에 처리하였을 때 대조구와 비교하여 생장이 억제되는 결과를 나타내었다. 그리고 목우연구소에서 MeOH 추출물(4 kg ai ha-1, 0.1% Tween 20 함유)을 화본과식물 2.5-3엽기, 광엽식물 2엽기의 5종 작물(옥수수[Zea mays], 콩[Glycine max], 목화[Gossypium hirsutum], 밀[Triticum aestivum], 벼[Oryza sativa])과 7종 잡초(물피[Echinochloa crus-galli var. echinata], 바랭이[Digitaria ciliaris], 쥐꼬리뚝새풀[Alopecurus myosuroides], 호밀풀[Lolium perenne], 어저귀[Abutilon theophrasti], 털비름[Amaranthus retroflexus], 도꼬마리[Xanthium strumarium])에 처리하고 12일 경과후 약해와 약효를 검정한 결과는 Table 2와 같았다. 가중나무 MeOH에 처리된 벼, 바랭이, 쥐꼬리뚝새풀, 호밀풀, 털비름, 도꼬마리는 육안 관찰 결과, 잎이 타는 듯한 증상(burning efficacy)를 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
Fig. 2. Photos showing plant growth retardation by application of MeOH extract of Ailanthis altissima Swinggle in greenhouse experiment. (Top) Photo showing growth retardaton by application of 0, 5,000, 10,000 ppm of MeOH extract of Ailanthis altissima Swinggle, (middle) photo showing effect of plant grwoth retardation by POST application of MeOH extract of Ailanthis altissima Swinggle, (bottom) photo showing effect of plant grwoth retardation by PRE application of MeOH extract of Ailanthis altissima Swinggle.
가중나무 MeOH 추출물의 용매분획 및 식물생장 억제활성
본 연구의 in vitro와 온실시험결과는 가중나무 MeOH 추출물에 식물 생장을 억제하는 생리활성물질이 함유되어 있다는 것을 추론하게 하였다. 이와 같은 신규의 발견을 근거로 식물생장 억제물질을 분리하고자 용매 분획을 실시하였다. 가중나무 MeOH 추출물을 헥산(Hex), 디클로로메탄(CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH), 물(d-H2O)의 순서로 순차적으로 용매의 극성을 높여가면서 분획하여 분획물을 얻었고, 식물생장억제 효과를 검정한 결과 각 추출물의 GR50값은 8,539, 1,365, 561, 5,049, 19,989 μg g-1이었다. 가중나무 MeOH 분획물의 식물생장억제 효과 검정 결과, EtOAc 분획물이 가장 효과가 높았기에 EtOAc 분획물을 분리하여 5개의 분리물을 얻었다. EA (Rf 0.975), EB (Rf 0.675, EC (Rf 0.575), ED (Rf 0.275, EE (Rf 0.000). 5개의 분리물을 컬럼크로마토그래피를 통해 얻은 분리물을 감압농축 및 동결건조하여 건조물을 얻었고, 분리물의 식물생장억제 효과를 유채를 대상으로 in vitro실험으로 검정한 결과는 Table 3에 나타내었다.
가중나무에서 분리한 EAC 분획물을 GC-MS로 분석한 결과, 단일물질로 확인되었으며 molecular ion (M+)은 m/z 117이고, fragment ion은 m/z 116, 100, 72, 58이었다(Fig. 3). GC-MS 결과를 바탕으로 EAC 분획물은 단일물질로 확인되었으며, acetone을 용매로 사용하여 1H-NMR (600 MHz)으로 분석한 결과 δ (ppm) 3.30 (9H, d, H-2, 3, 4), 3.85 (2H, s, H-1)에서 proton signal을 확인하였다(Fig. 4). 그리고 EAC 분획물을 acetone을 용매로 사용하여 13C-NMR (600 MHz)로 구조동정한 결과 δ (ppm) 52.39 (C-3, 3', 3""), 65.86 (C-2), 167.32 (C-1)에서 carbon signal을 확인하였다(Fig. 5). 최종적으로 GC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR 분석결과를 바탕으로 가중나무에 함유되어 있는 식물생장 억제물질은 화학구조식이 C5H11NO2, 분자량은 117.14인 glycine betaine (Methaneamoniun, 1-carboxy-N,N,N-trimethyl hydroxide, inner salt)으로 확인되었으며 그 화학구조는 Fig. 6과 같다.
Glycine betaine의 제초활성을 검정하기 위하여 유채를 이용하여 식물생장억제활성을 검정하였다. 실험에 사용된 glycine betaine은 Sigma 사에서 구입한 것으로 실험결과 GR50값은 91 μg g-1로 가중나무 EAC 분리물의 GR50값과 크게 다르지 않았다. 이 결과로부터 저자들은 가중나무로부터 분리한 glycine betaine이 확실하게 식물생장억제효과를 보였다는 것을 알 수 있었다.
저자들이 가중나무로부터 식물생장 억제물질로 분리한 glycine betaine은 식물이 저온, 고온, UV 빛, 중금속 등의 환경 스트레스에 노출되면 생체내에 축적되는 유기 osmolite이다. glycine betaine은 지방 peroxidation을 통해 지방막의 구성분, 구조, 기능에 변화를 주어 세포막의 붕괴를 막는 것으로 알려져 있다. 외부에서 공급된 glycine betaine은 항산화효소와 proline 대사를 조절하여 저온에 노출된 Nanguo 배의 과피 갈색화를 예방할 뿐만 아니라(Sun et al., 2020), 호박의 저온피해를 항산화 효소 지방막대사 조절을 통해 경감시키는 것으로 보고되었다(Yao et al., 2018). Glycine betaine은 식물체내에서 삼투압을 조절하는 물질이라 알려져 있지만 가중나무에서 축적된 glycine betaine이 어떻게 식물생장억제효과를 나타냈는지에 대한 면밀한 연구가 요구된다. 본 연구에서 glycine betaine을 경엽에 처리하였을 때 일부 식물은 잎이 타는buring effect를 나타내었는데(자료미제시), 학술 검색에서도 glycine betaine이 이러한 증상을 나타낸다는 문헌은 발견할 수 없었기에 고약량의 glycine betaine이 외부에서 투입되면 지방막의 조성, 구조, 기능에 변화가 일어나고, 이로 인해서 식물 잎에서 그런 증상이 나타난 것이 아닌가 추론해본다. 이 현상에 대해서도 향후 자세한 연구가 이루어져야 할 것이다.
Acknowledgment
This work was supported by the Korean Ministry of Environment (Grant no. 2018002270002).
Authors Information
Misun Yun, Kangwon National University, MSc Graduate
Jung Sup Choi, Korea Research Institute of Chemical Technology, Principal Research Scientist
NamKyu Cho, Moghu Research Center Ltd., Senior Researcher
Sang-sup Han, Jeonbuk National University, Professor
Songmun Kim, http://orcid.org/0000-0002-802-7569
